力達(dá)霉素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤抑制作用及聯(lián)合替莫唑胺的協(xié)同作用研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，是高度血管化的血管生成依賴性生長(zhǎng)的人類腫瘤。目前的報(bào)道表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血管微環(huán)境在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展、侵襲、臨床診斷及治療效果中起關(guān)健性作用。腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為化療的靶標(biāo)之一。盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療已經(jīng)取得了很多進(jìn)步，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者的預(yù)后及診斷仍然很不理想，死亡率仍然很高。新的治療策略仍然有待研究。 力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM，C—1027)是烯二炔類抗生素家族的一個(gè)成員，它具有

2、很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、抗血管生成活性及抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長(zhǎng)的作用，力達(dá)霉素已經(jīng)在中國(guó)進(jìn)入了臨床研究。為測(cè)試力達(dá)霉素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制，對(duì)力達(dá)霉素作用于大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后的效應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)，以揭示其抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的效果。 替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是目前治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效藥物，臨床前研究與臨床研究已經(jīng)證實(shí)了替莫唑胺具有很強(qiáng)的抗血管生成活性及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，它能夠顯著提高腫瘤患者的

3、生存率。替莫唑胺與其他類藥物聯(lián)合治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤已經(jīng)取得了更為有效的結(jié)果，替莫唑胺新的聯(lián)合治療方法已經(jīng)受到了科研工作者的高度重視。本研究探索力達(dá)霉素與替莫唑胺對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的體外與體內(nèi)作用，以期應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療。 1.LDM對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及與TMZ聯(lián)合的效果。 MTT分析表明，LDM(10-7mol/L～10-14mol/L)能夠顯著抑制大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，其IC50值分別為5.

4、86×10-11mol/L和2.05×10-11mol/L。LDM(10-10mol/L～10-14mol/L)與TMZ(60μmol/L，90μmol/L，120μmol/L，150μmol/L)聯(lián)合處理72小時(shí)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制存在著協(xié)同作用。AnnexinV—FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀結(jié)果表明LDM(0.1nmol/L，0.5nmol/L，1nmol/L)以劑量依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。LDM與TM

5、Z聯(lián)合能夠顯著增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6和U87細(xì)胞的凋亡率，這與Western blot結(jié)果提示兩藥聯(lián)合協(xié)同增強(qiáng)了P53凋亡途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)。 2.LDM對(duì)體外模擬腫瘤微環(huán)境的影響及與TMZ聯(lián)合效果。 LDM單藥(0.1nmol/L，0.5nmol/L，1nmol/L)能夠以劑量依賴方式顯著抑制大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲。LDM(0.1nmol/L)與TM2(200μmol/L)聯(lián)合用藥后，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯的減少，與單獨(dú)用藥組比較

6、，P值均小于0.001，二者存在明顯的協(xié)同作用，協(xié)同指數(shù)為0.68。蛋白印跡的結(jié)果表明LDM與TMZ聯(lián)合抑制大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲與其抑制VEGFR2活性及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達(dá)有關(guān)。以不同藥物組合處理大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞rBMEC的共培養(yǎng)系統(tǒng)72小時(shí)后，與對(duì)照組比較，大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受到了藥物處理的顯著抑制，聯(lián)合處理組的遷移細(xì)胞數(shù)受到更為明顯的抑制，與單獨(dú)用藥組比較，P值均小于0.

7、001，聯(lián)合指數(shù)為0.72，ELISA方法與蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明這與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基中VEGF的表達(dá)受到藥物聯(lián)合處理的明顯抑制有關(guān)，也與大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR的活性和神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和U87細(xì)胞VEGF的表達(dá)受到協(xié)同抑制有關(guān)。 3.LDM對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和體外血管生成的影響及與TMZ聯(lián)合效果。 LDM對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有強(qiáng)烈的抑制作用，其IC50值為1.06×10-11mol

8、/L，同時(shí)也存在著劑量依賴性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用。LDM與TMZ聯(lián)合后可增強(qiáng)細(xì)胞毒作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。LDM可以阻斷內(nèi)皮細(xì)胞形成的小管，并隨著劑量加大，破壞小管的能力越強(qiáng)。LDM0.1nmol/L與TMZ200μmol/L聯(lián)合處理內(nèi)皮細(xì)胞，形成的管狀結(jié)構(gòu)要比LDM0.1nmol/L組少，P<0.01，與TMZ200μmol/L相比較，P<0.001，二者的聯(lián)合指數(shù)為0.75。LDM0.1nmol/L或TMZ200μmol/L作用于大

9、鼠動(dòng)脈環(huán)后，都顯示了明顯的抑制作用，二者聯(lián)合后能夠更為明顯的抑制動(dòng)脈環(huán)發(fā)芽，與單獨(dú)用藥組比較P值均小于0.001，聯(lián)合指數(shù)為0.8。 4.LDM與TMZ聯(lián)合對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制。 LDM0.025mg/kg和0.05mg/kg能夠顯著抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，TMZ也能夠顯著抑制腫瘤人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比較，P值均小于0.001。各藥物處理組對(duì)動(dòng)物體重都沒有明顯的影響。腫瘤生長(zhǎng)曲

10、線和瘤重量分析結(jié)果顯示，LDM與TMZ單藥能夠產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果，LDM0.025mg/kg和0.05mg/kg分別與TMZ0.5mg/kg聯(lián)合能夠更為顯著的抑制腫瘤的生長(zhǎng)，聯(lián)合指數(shù)小于1，表明二者能夠協(xié)同抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。 經(jīng)原位TUNEL檢測(cè)，LDM單藥能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且隨著劑量加大，凋亡率也增加。LDM與TMZ0.5mg/kg聯(lián)合后可明顯的增加凋亡率，與單獨(dú)用藥組比較P值均小于0.001，LDM0.025mg/k

11、g和0.05mg/kg與TMZ聯(lián)合的協(xié)同指數(shù)分別為0.75和0.77，表明二者在體內(nèi)協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 CD31的免疫組織化學(xué)分析表明，LDM單藥、TMZ單藥及二者聯(lián)合都能夠降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87裸鼠移植瘤血管密度，與對(duì)照組相比較均存在顯著性差異。二者聯(lián)合能夠更為顯著的抑制腫瘤組織的血管生成，LDM0.025mg/kg和0.05mg/kg分別與TMZ0.5mg/kg聯(lián)合后，其抑制腫瘤血管生成的協(xié)同指數(shù)分別為0.88和0.78，表

12、明二者能夠協(xié)同抑制腫瘤血管生成。同時(shí)，VEGF的免疫組織化學(xué)分析表明，LDM與TMZ聯(lián)合對(duì)腫瘤組織中VEGF的表達(dá)也產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，LDM0.025mg/kg與TMZ0.5mg/kg的協(xié)同指數(shù)為0.93；LDM0.05mg/kg與TMZ0.5mg/kg抑制VEGF表達(dá)的協(xié)同指數(shù)為0.42。 本研究工作采用MTT法分析了藥物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，采用AnnexinV—FITC/PI法檢測(cè)了藥物處理后細(xì)胞凋

13、亡，同時(shí)，為了更全面的反映神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管微環(huán)境，從腫瘤旁分泌網(wǎng)絡(luò)考慮，采用共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察了藥物對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的影響，包括細(xì)胞遷移和VEGF的分泌。以大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成實(shí)驗(yàn)和大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)作為體外血管生成的模型，來分析藥物對(duì)血管生成的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在分析了力達(dá)霉素與替莫唑胺聯(lián)合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，同時(shí)也分析了二者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞凋亡和微血管密度及VEGF表達(dá)的影響。本研究證明：力達(dá)霉素強(qiáng)烈抑