趨化因子受體CCR4在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)功能研究.pdf

1、胃癌的發(fā)生與發(fā)展涉及多因素、多階段，在此過程中，趨化因子受體(chemokinereceptor)作為腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的有利工具，對(duì)腫瘤的惡性行為起著關(guān)鍵作用。趨化因子受體是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，可表達(dá)在不同類型的細(xì)胞上。胃腫瘤細(xì)胞能表達(dá)不同的趨化因子受體，如CXCR4和CCR7，并通過這些分子發(fā)生轉(zhuǎn)移。近期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞表達(dá)CC型趨化因子受體—CCR4，并與胃癌轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)，但調(diào)控其表達(dá)的關(guān)鍵因子及

2、具體機(jī)制不明。以往研究顯示，CCR4選擇性地表達(dá)在Th2型細(xì)胞及Treg細(xì)胞上，對(duì)于調(diào)節(jié)免疫平衡或抑制腫瘤免疫具有重要作用;CCR4陽性的成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤細(xì)胞，因具有Treg細(xì)胞樣的功能而能夠逃逸宿主免疫。雖然這些研究顯示了CCR4具有與免疫抑制相關(guān)的功能，但其研究角度一般是從該受體的趨化活性出發(fā)，且主要聚焦于免疫細(xì)胞或非實(shí)體腫瘤細(xì)胞，而關(guān)于CCR4在實(shí)體腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的研究數(shù)據(jù)比較有限，并且CCR4自身是否具有免疫調(diào)節(jié)的功能未

3、知。另一方面，某些研究提示，腫瘤細(xì)胞不僅借助于趨化因子受體及相應(yīng)配體的相互作用獲得趨化活性而進(jìn)行遷移，還可以通過該途徑上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性而進(jìn)行侵襲，目前尚無關(guān)于CCR4與腫瘤侵襲能力相互關(guān)系方面的研究。在本研究中，我們選取胃癌臨床標(biāo)本、采用胃癌細(xì)胞系及建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，分別通過IHC（免疫組化）、IHF（免疫組織熒光）、基因轉(zhuǎn)染、實(shí)時(shí)定量RT-PCR、FCM（流式細(xì)胞術(shù)）、懸浮芯片、侵襲實(shí)驗(yàn)的方法，從明確CCR4在胃癌細(xì)胞中表達(dá)

4、的調(diào)節(jié)因素及分析其參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲作用的新視角，揭示CCR4在胃癌中表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)生物學(xué)功能，為闡釋趨化因子受體相關(guān)的腫瘤進(jìn)展機(jī)制及尋找胃癌臨床治療新靶點(diǎn)提供重要數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　 第一部分CCR4在胃癌中的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制
　　 目的:
　　 分別檢測(cè)CCR4在胃不典型增生組織、胃癌和配對(duì)的癌旁組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)，分析CCR4的表達(dá)分布特點(diǎn)及其在胃癌中的表達(dá)調(diào)節(jié)因素和調(diào)控機(jī)

5、制。
　　 方法:
　　 1.選用石蠟包埋的臨床組織標(biāo)本，包括胃不典型增生組織56例，胃癌和相應(yīng)癌旁組織各63例，及配對(duì)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌42例，通過IHC檢測(cè)分析CCR4的表達(dá)分布特點(diǎn)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;同時(shí)檢測(cè)胃癌組織中TNF-α的表達(dá)，分析CCR4與TNF-α在胃癌中表達(dá)的相關(guān)性。
　　 2.采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、FCM檢測(cè)CCR4在胃癌細(xì)胞系MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、A

6、GS（中分化）、MKN-45（低分化）中的表達(dá)。
　　 3.通過采用不同細(xì)胞因子（MCP-1、OPN、CCL22、TNF-α）刺激的方法，觀察CCR4表達(dá)的調(diào)控因素;及通過加信號(hào)通路抑制劑的方式研究CCR4表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.IHC結(jié)果顯示，CCR4在胃癌組織中的陽性率(27/63;42.9％)顯著高于癌旁(0/63;0)及胃不典型增生組織(2/56;3.6％)（P均＜0.001）;腫瘤原發(fā)

7、部位組織中CCR4的陽性率(15/42;35.7％)顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(35/42;83.3％)（P＜0.01）;胃癌組織中CCR4的表達(dá)與TNF-α成正比(P＜0.05)。
　　 2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，四種胃癌細(xì)胞系間CCR4mRNA的表達(dá)無顯著差異（P均＞0.05）;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞系中CCR4蛋白均處于低表達(dá)狀態(tài)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　 3.細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn)顯示，TNF

8、-α可通過NF-κB信號(hào)途徑以劑量依賴方式上調(diào)胃癌細(xì)胞中CCR4的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CCR4在癌旁胃正常粘膜中不表達(dá)，在胃不典型增生組織中開始出現(xiàn)弱陽性，在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中出現(xiàn)更高的陽性表達(dá)率，可見隨著胃腫瘤的發(fā)生及惡性演進(jìn)，CCR4的表達(dá)出現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)。
　　 2.CCR4在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)和分化程度無關(guān)，胃癌細(xì)胞本身不能組成性高表達(dá)CCR4，而是由腫瘤微環(huán)境中的某些

9、因素（如TNF-α炎癥刺激）所誘導(dǎo)表達(dá)，并受到NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　 3.以往研究報(bào)道CCR4在胃癌中表達(dá)，本研究則通過對(duì)比分析不同來源的胃組織標(biāo)本中CCR4的表達(dá)分布特征，及采用細(xì)胞系的細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確了CCR4在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)及其表達(dá)的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。
　　 第二部分胃癌細(xì)胞異常表達(dá)CCR4在腫瘤免疫中的調(diào)節(jié)作用
　　 目的:
　　 分析淋巴細(xì)胞豐富的胃

10、癌及常見胃癌兩組間CCR4表達(dá)的差異，并通過建立體外共培養(yǎng)體系，觀察胃癌細(xì)胞高表達(dá)CCR4對(duì)腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1.通過IHC分析CCR4在淋巴細(xì)胞豐富的胃癌和常見胃癌兩組間的差異表達(dá);
　　 2.應(yīng)用SGC-7901胃癌細(xì)胞系，通過體外脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法使其過表達(dá)帶EGFP的CCR4，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，獲得高表達(dá)CCR4的胃癌細(xì)胞模型，并與

11、通過Ficoll分離獲得的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)建立共培養(yǎng)體系;
　　 3.采用FCM及懸浮芯片分別觀察SGC-7901細(xì)胞系過表達(dá)CCR4后對(duì)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子及GrA（顆粒酶A）、GrB、穿孔素產(chǎn)生的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.IHC結(jié)果顯示，CCR4在淋巴細(xì)胞豐富的胃癌中的表達(dá)陽性率顯著高于常見胃癌（P＜0.05），并伴有與Th2型免疫反應(yīng)有關(guān)的生發(fā)中心形成現(xiàn)象發(fā)生;
　　 2.實(shí)時(shí)定

12、量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM均證實(shí)獲得瞬時(shí)高表達(dá)CCR4的細(xì)胞模型。所建立的共培養(yǎng)體系中，PBMC+CCR4組IFN-γ的分泌水平較PBMC+MOCK對(duì)照組(P＜0.01)及PBMC+CCR4+復(fù)合物39組(P＜0.05)顯著降低，而IL-10的分泌水平較其他兩組顯著升高（P均＜0.01）;同時(shí)，PBMC+CCR4組的CD56+NK表達(dá)GrzA的水平較PBMC+MOCK和PBMC+CCR4+復(fù)合物39兩組顯著降低(P均＜0.0

13、5)，而GrzB和穿孔素的水平未見組間差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.胃癌細(xì)胞異常高表達(dá)CCR4可負(fù)向調(diào)控抗腫瘤免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌向Th2型偏移，并抑制免疫細(xì)胞毒效應(yīng)分子的分泌。
　　 2.與以往報(bào)道的由CCR4趨化性間接引起的免疫抑制不同，本研究證實(shí)了CCR4自身所具有的腫瘤免疫調(diào)控功能，為CCR4作為胃癌潛在免疫治療靶點(diǎn)的可能性提供了重要數(shù)據(jù)支持。
　　 第三部分CCR4在pNO胃癌患者中的

14、表達(dá)及其在腫瘤侵襲中的作用
　　 目的:
　　 本研究旨在通過觀察CCR4在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者(pNO)腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)，分析CCR4與腫瘤侵襲性的關(guān)系，并在細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證及進(jìn)一步闡釋CCR4介導(dǎo)的腫瘤侵襲機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.選取pNO的胃癌病人70例，采用IHC及IHF方法檢測(cè)腫瘤標(biāo)本中CCR4的表達(dá)，并進(jìn)行臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析;
　　 2.應(yīng)用SGC-7901、BGC-

15、823胃癌細(xì)胞系，通過體外脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MOCK對(duì)照質(zhì)?；駿GFP-CCR4質(zhì)粒載體，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;
　　 3.采用侵襲試驗(yàn)，觀察SGC-7901細(xì)胞系過表達(dá)CCR4后對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響;
　　 4.分別通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR及明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞系過表達(dá)CCR4后對(duì)MMP9基因及蛋白水平表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.IHC及IHF顯

16、示，CCR4在pNO胃癌病人腫瘤組織中具有兩種表達(dá)模式，分化較好的胃癌細(xì)胞為胞膜和胞漿同時(shí)存在（M+C型）為主，分化較差的胃癌細(xì)胞表達(dá)模式以胞漿型（C型）為主，具有侵襲行為的腫瘤細(xì)胞CCR4表達(dá)模式表現(xiàn)為C型。CCR4的表達(dá)與pNO胃癌患者T分期呈正相關(guān)(P＜0.05);
　　 2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR、熒光顯微鏡觀察及FCM均證實(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明，胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823過表達(dá)CCR4后，在不依

17、賴外源性配體刺激的條件下侵襲能力較MOCK對(duì)照組顯著增加(P＜0.05);
　　 3.實(shí)時(shí)定量RT-PCR及明膠酶譜實(shí)驗(yàn)分別顯示，在有無或外源性配體刺激條件下，與MOCK對(duì)照組相比，CCR4均能顯著上調(diào)SGC-7901和BGC-823細(xì)胞MMP9基因表達(dá)水平(P＜0.05)及明顯增加MMP9蛋白分泌。
　　 結(jié)論:
　　 1.pNO患者胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)侵襲行為與CCR4的表達(dá)呈正相關(guān)，且表現(xiàn)為高侵襲性的胃癌細(xì)胞中C