Abl基因敲除在調(diào)控血管平滑肌張力中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、原發(fā)性高血壓，中風(fēng)，缺血性心臟病，肺動(dòng)脈高壓和其他一些心血管疾病是現(xiàn)代化社會(huì)主要引起死亡的病因。雖然在臨床研究中已經(jīng)投入巨資，但這些疾病還未能得到解決。而引起上述疾病的重要因素包含血管張力異常，因此對(duì)調(diào)節(jié)平滑肌收縮性的因素的研究是目前的熱門課題。平滑肌的收縮是由粗細(xì)肌絲之間的相互滑動(dòng)形成的，在此過(guò)程中，構(gòu)成粗肌絲的肌球蛋白輕鏈磷酸化是啟動(dòng)粗細(xì)肌絲之間滑動(dòng)的關(guān)鍵步驟。早先的認(rèn)識(shí)認(rèn)為構(gòu)成細(xì)肌絲的肌動(dòng)蛋白是固定結(jié)構(gòu)，而最近的研究表明，除了肌球

2、蛋白輕鏈磷酸化之外，平滑肌肌動(dòng)蛋白也處于動(dòng)態(tài)，肌動(dòng)蛋白的聚合－解離的過(guò)程也在平滑肌張力產(chǎn)生中起重要作用。Abl屬于非受體酪氨酸激酶家族，有證據(jù)表明在非肌肉細(xì)胞細(xì)胞中，Abl可以通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，伸展，胞緣波動(dòng)和細(xì)胞黏附等活動(dòng)。而Abl在調(diào)節(jié)平滑肌肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)中的作用及其對(duì)于平滑肌張力方面的作用則有待進(jìn)一步發(fā)掘。 目的:基于上述理論基礎(chǔ)，本研究采用Abl基因敲除小鼠，對(duì)其與野生型小鼠的尾動(dòng)脈血壓，動(dòng)脈

3、血管平滑肌層厚度，在收縮刺激后的血管平滑肌肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，肌球蛋白輕鏈磷酸化變化，及Abl下游因子及相關(guān)收縮蛋白的表達(dá)方面進(jìn)行研究。探討Abl在平滑肌收縮及細(xì)胞收縮骨架蛋白中的作用。 方法和結(jié)果: 第1部分、尾動(dòng)脈血壓測(cè)定及血管中層厚度測(cè)量。 1. 尾動(dòng)脈血壓測(cè)定。 方法：采用XBP1000型（Kent Scientific公司）無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行血壓測(cè)量。 結(jié)果：Abl基因敲除組小鼠的尾動(dòng)

4、脈血壓較野生型小鼠的尾動(dòng)脈血壓為低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2. 動(dòng)脈血管中層厚度測(cè)量。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的頸動(dòng)脈，冰凍切片后以相差顯微鏡拍照，并在專業(yè)軟件下測(cè)量動(dòng)脈中層厚度。 結(jié)果：Abl基因小鼠和野生小鼠頸動(dòng)脈中層管壁厚度相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第2部分、收縮刺激后，動(dòng)脈血管肌球蛋白輕鏈磷酸化檢測(cè)和肌動(dòng)蛋白聚合狀態(tài)檢測(cè)。 1. 動(dòng)脈血管肌球蛋白輕鏈磷酸化檢測(cè)分組：a.野生型對(duì)

5、照組；b.野生型脫羥腎上腺素刺激組；c.Abl基因敲除型對(duì)照組；d.Abl基因敲除型脫羥腎上腺素刺激組。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的頸動(dòng)脈，股動(dòng)脈，主動(dòng)脈等，以特定濃度脫羥腎上腺素刺激一定時(shí)間后以免疫印跡方法測(cè)定肌球蛋白輕鏈磷酸化程度。 結(jié)果：在脫羥腎上腺素刺激后，Abl基因敲除型小鼠動(dòng)脈和野生型小鼠動(dòng)脈肌球蛋白輕鏈磷酸化水平無(wú)明顯差異。 2. 動(dòng)脈血管肌動(dòng)蛋白聚合狀態(tài)檢測(cè)分組：a.野生型對(duì)照組；b.野

6、生型脫羥腎上腺素刺激組；c.野生型血管緊張素2刺激組；d.Abl基因敲除型對(duì)照組；e.Abl基因敲除型脫羥腎上腺素刺激組；f.Abl基因敲除型血管緊張素2刺激組。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的頸動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈，以特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激一定時(shí)間后以免疫熒光方法測(cè)定肌動(dòng)蛋白聚合程度。 結(jié)果：經(jīng)以特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激后，Abl敲除小鼠動(dòng)脈血管由刺激引起的肌動(dòng)蛋白聚合程度較野生型小鼠動(dòng)

7、脈血管降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第3部分：收縮刺激后Crk相關(guān)底物磷酸化水平檢測(cè)和收縮相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定。 1. Crk相關(guān)底物(CAS)磷酸化水平檢測(cè)分組：a.野生型對(duì)照組；b.野生型脫羥腎上腺素刺激組；c.野生型血管緊張素2刺激組；d.Abl基因敲除型對(duì)照組；e.Abl基因敲除型脫羥腎上腺素刺激組；f.Abl基因敲除型血管緊張素2刺激組。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈和股動(dòng)脈，以

8、特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激一定時(shí)間后，以免疫印跡方法測(cè)定CAS 磷酸化程度。 結(jié)果：經(jīng)以特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激后，在野生小鼠動(dòng)脈血管中CAS磷酸化程度增加，而Abl敲除小鼠動(dòng)脈血管CAS磷酸化增加程度較野生型小鼠動(dòng)脈血管降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2. 收縮相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的主動(dòng)脈和腸系膜動(dòng)脈和股動(dòng)脈及肺組織。以免疫印跡方法測(cè)定paxillin

9、，vinculin和肌動(dòng)蛋白在血管組織中的水平。以定量逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)paxillin，vinculin和GAPDH的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)。 結(jié)果：在Abl基因敲除小鼠動(dòng)脈血管中，paxillin和vinculin蛋白水平較野生型小鼠動(dòng)脈血管中相應(yīng)蛋白水平低，并且在Abl基因敲除小鼠肺組織中paxillin和vinculin的mRNA水平也較野生型小鼠動(dòng)脈血管中相關(guān)基因mRNA水平低。 結(jié)論: 1. Abl基

10、因敲除小鼠尾動(dòng)脈血壓較野生型小鼠尾動(dòng)脈血壓偏低。且Abl基因敲除小鼠和野生型小鼠的頸動(dòng)脈中層厚度相同，提示Abl不影響平滑肌層的整體結(jié)構(gòu)和厚度。 2. Abl基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其動(dòng)脈血管在受到收縮刺激后肌動(dòng)蛋白聚合的增加水平降低，而肌球蛋白輕鏈磷酸化水平則與野生型無(wú)明顯差異，提示Abl對(duì)于平滑肌張力調(diào)節(jié)是通過(guò)影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)而發(fā)生作用。 3. Abl基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其動(dòng)脈血管在受到收縮刺