胃癌DNA異常甲基化影響CXC型趨化因子CXCL14表達(dá)水平的研究.pdf

1、背景:
　　胃癌作為我國(guó)第二大惡性腫瘤，總體5年生存率不到20％，缺乏特異性早期診斷方式和有效治療方法是目前的研究短板。CXCL14(C-X-C motif chemokineligand14)，作為趨化因子CXC子家族中新的一員，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在人體大部分組織中普遍表達(dá)。而在不同的人體惡性實(shí)體腫瘤中CXCL14的表達(dá)情況高低不一。但在胃惡性腫瘤中CXCL14的表達(dá)水平和臨床意義未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:
　　檢測(cè)胃癌組織和配

2、對(duì)正常胃粘膜組織中CXCL14的表達(dá)情況，探討表達(dá)差異的形成原因，并聯(lián)系臨床病理分型，尋找在臨床上的應(yīng)用意義。
　　方法:
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-PCR)的方法檢測(cè)60例腫瘤/正常配對(duì)樣本中CXCL14信使RNA水平的表達(dá)差異。蛋白印跡法(Western Blot)驗(yàn)證多克隆抗原特異性后，免疫組織化學(xué)染色方法(Immunohistochemistry)檢測(cè)30例腫瘤/正常配對(duì)樣本中CXCL14蛋白水平

3、的表達(dá)差異。CXCL14 DNA啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平采用重亞硫酸鹽測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR)驗(yàn)證。將胃癌細(xì)胞株AGS、SCG7901、BGC823和MGC803在去甲基化藥物地西他濱（5-Aza-2'-deoxycytidine）不同濃度梯度處理后，采用Realtime-PCR檢測(cè)CXCL14信使RNA表達(dá)恢復(fù)情況。最后聯(lián)系臨床病理分型和生存分析，利用卡方檢驗(yàn)、Student's T檢驗(yàn)、Kruskal-

4、Wallis H檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存曲線、Cox回歸方程等統(tǒng)計(jì)方法探討CXCL14的臨床意義。
　　結(jié)果:
　　相對(duì)于配對(duì)胃正常粘膜組織，CXCL14信使RNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.569，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在配對(duì)胃正常粘膜組織中CXCL14蛋白半定量表達(dá)水平約為90％以上，而腫瘤組織中蛋白水平降為60％左右，兩者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。在30例配對(duì)胃癌組織標(biāo)本中，正

5、常組織中CXCL14 DNA啟動(dòng)子區(qū)域51個(gè)甲基化位點(diǎn)整體甲基覆蓋率為14.58％(223/1530)，而腫瘤組織中甲基化水平高于正常組織2倍以上，為32.29％(494/1530)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。將51個(gè)甲基化位點(diǎn)細(xì)分為啟動(dòng)子區(qū)域和第一外顯子區(qū)域時(shí)，發(fā)現(xiàn)主要的甲基化差異存在于啟動(dòng)子區(qū)域，正常/腫瘤組織甲基化率為13.96％(201/1440)∶32.36％(466/1440)，兩者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

6、001）。而第一外顯子區(qū)域未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.498)。再將甲基化位點(diǎn)逐一分析，發(fā)現(xiàn)第2、6、7、8、9號(hào)甲基化位點(diǎn)在正常組織中甲基化率為0，而腫瘤組織中高達(dá)40.67％，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。轉(zhuǎn)向細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，當(dāng)?shù)匚魉麨I處理胃癌細(xì)胞株AGS、SCG7901、BGC823和MGC803五天后，AGS、SCG7901和BGC823中CXCL14信使RNA的表達(dá)量得到提高(P＜0.001)。但在不同的藥物濃度之間，表達(dá)恢

7、復(fù)情況未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AGS細(xì)胞DNA甲基化測(cè)序分析示在去甲基藥物處理后，CXCL14啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率從用藥前的85.62％下降到12.55％(P＜0.001)，但在藥物濃度梯度之間甲基化水平改變?nèi)晕匆?jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)合臨床病理分型，CXCL14信使RNA水平和腫瘤浸潤(rùn)深度存在相關(guān)(P＜0.001)，且對(duì)腫瘤中晚期病人（Ⅲ/Ⅳ期）的5年生產(chǎn)率存在影響。最后它作為一個(gè)判斷胃癌預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，相對(duì)危險(xiǎn)