多發(fā)性骨髓瘤14q32染色體易位的分子生物學(xué)研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是漿細胞的惡性增殖性疾病，至今仍屬不能治愈的腫瘤。深入研究MM的發(fā)病機制，尋找致病的關(guān)鍵性分子異常及針對性治療策略是目前MM研究中的熱點問題。免疫球蛋白重鏈基因(ImmunoglobulinHeavyChain，IgH)相關(guān)的染色體易位是MM最常見的染色體結(jié)構(gòu)異常，被認為是發(fā)病過程中早期的、特征性的分子事件，可能在MM發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 該研究建立了便捷的IgH基因相關(guān)染色

2、體易位的分子生物學(xué)檢測方法以應(yīng)用于臨床檢測，并對有t(4；14)的骨髓瘤的分子發(fā)病機制與繼發(fā)的癌基因異常表達作為治療靶點的意義進行了初步的研究。 第一部分 參考國外專利文獻與研究報道，自行設(shè)計并合成了6種分別針對限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，ClaⅠ，EcoRⅠ，HindH，PvuⅡ，Rasl的雙鏈短DNA片段小載體。構(gòu)建了健康人外周血單個核細胞與骨髓瘤細胞株U266細胞的小載體文庫。應(yīng)用LaTaq酶，以通用型小載體

3、引物與S區(qū)的引物行半巢式長距離PCR擴增各小載體文庫，健康人外周血單個核細胞基因組的PvuⅡ文庫，以通用小載體引物與巢式引物m1：m2；a1：a2；g1：g2可分別擴增出250bp、610bp、750bp的與預(yù)想片段大小一致的片段。對U266的EcoRⅠ小載體文庫，以小載體引物和a1：a2可以擴增出3.5kb的片段。PCR產(chǎn)物測序證實該骨髓瘤細胞存在t(11;14)。說明此方法可以有效的檢測IgH基因相關(guān)的染色體易位，可大規(guī)模應(yīng)用于臨床

4、檢測。 第二部分 1、以多種公共軟件對MMSET進行了的生物信息學(xué)分析。 2、設(shè)計針對SET結(jié)構(gòu)的引物，以RT-PCR方法從骨髓瘤細胞株LP1中得到編碼MMSET的SET結(jié)構(gòu)的870bp的cDNA片段。 3、將此片段克隆至pGEX-6p1，成功的構(gòu)建了MMSET的表達載體，命名為pGEX-6p1-MMSET。并在大腸桿菌中表達出融合蛋白。 4、將產(chǎn)物與H3-SAM和核心組蛋白共孵育，SD

5、S-PAGE電泳后，行放射自顯影，可以見到在H3和H4組分對應(yīng)的位置的顯影，說明該重組蛋白有上述兩種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。對MMSET的該功能的揭示，提示組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的功能的改變，可能通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，活化癌基因或抑制抑癌基因的表達，參與MM的發(fā)生。 第三部分 t(4；14)的MM的一個特點是高表達細胞周期蛋白D2，可能是染色體易位引起的，可能是骨髓瘤發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)。在此部分中，設(shè)計并構(gòu)

6、建了針對cyclinD2的ShRNA表達質(zhì)粒，經(jīng)測序證實模板的正確插入。以陽離子聚合物方法轉(zhuǎn)染LP1細胞株，轉(zhuǎn)染率為34.2％，RT-PCR可見轉(zhuǎn)染后cyclinD2的表達明顯降低，說明對靶基因有明顯的抑制作用。LP1細胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)了生長曲線明顯低平，MTT方法檢測細胞增殖明顯受到抑制，細胞周期分析出現(xiàn)了S期細胞減少，G1期細胞增多，AnnexinV檢測，細胞出現(xiàn)了中度的凋亡，72小時的凋亡率為25.7±4.7％。說明抑制cyclinD