Bax通路在mfn2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中作用的研究.pdf

1、目的:增殖抑制基因(HSG)又稱為線粒體融合蛋白基因(mfn2)能夠有效的抑制受損傷血管平滑肌增殖及細(xì)胞周期,使細(xì)胞停滯于G0/G1期,近來文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)fn2基因能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,本實(shí)驗(yàn)主要探討HSG基因誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制,以及觀察Bax/Bcl-2蛋白家族及其凋亡通路以及線粒體凋亡通路在mfn2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 方法:構(gòu)建含mfn2 cDNA片段的腺病毒Ad-mfn2以及質(zhì)粒pE

2、GFP-C2-mfn2和pCDNA3.1⊕-mfn2,體外感染或轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞內(nèi),并以含有綠色熒光蛋白的腺病毒Ad-GFP以及空白質(zhì)粒pEGFP-C2、pCDNA3.1⊕為陰性對照組,Western Blot檢測HSG高表達(dá)組和對照組細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路關(guān)鍵蛋白Bax、Bcl-2、p53、caspase-3、caspase-9、PARP、Apaf-1等的差異,流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞周期及凋亡的變化.分離并提純肝癌細(xì)胞線粒體蛋白及胞漿蛋白

3、,Western Blot觀察細(xì)胞色素C和Bax在細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器中含量的變化。構(gòu)建短發(fā)卡RNA shR-mfn2和shR-bax并共轉(zhuǎn)染入正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)、DNAladder和CCK-8檢測細(xì)胞凋亡和增殖的變化,報(bào)告基因方法檢測肝癌細(xì)胞高表達(dá)mfn2基因后caspase-3活性的變化。
　　 結(jié)果:感染Ad-mfn2的mfn2高表達(dá)組和轉(zhuǎn)染pCDNA3.1⊕-mfn2的中表達(dá)組凋亡顯著增加(p＜0.01)

4、,較對照組細(xì)胞總蛋白內(nèi)Bax、Bcl-2、p53表達(dá)無顯著性差異,但Caspase-3、PARP、Apaf-1蛋白表達(dá)顯著增加(p=0.004、p=0.045、p=0.010)。Ad-mfn2轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的HepG2后,細(xì)胞周期阻滯在Go/G1期,S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少,而凋亡顯著增加。高表達(dá)HSG細(xì)胞線粒體蛋白內(nèi)細(xì)胞色素C減少、Bax增加,相對細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C增加、Bax減少,兩者有顯著性差異(細(xì)胞色素C:p=0.024 VS p=0.0

5、40;Bax:p=0.018 VS p=0.039)。正常肝細(xì)胞shRNA干擾mfn2表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,其與干擾bax表達(dá)組無顯著性差異(p=0.196)。高表達(dá)mfn2組肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染入shR-bax使細(xì)胞凋亡顯著被抑制(p=0.0103)。肝癌細(xì)胞高表達(dá)mfn2基因后caspase-3活性相對于對照組及空白對照組顯著增加(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:mfn2基因過表達(dá)可以抑制肝癌的生長,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,mfn2是潛在