IL-24突變體的構(gòu)建及其泛素化位點(diǎn)的確定.pdf

1、目的:尋找IL-24泛素化位點(diǎn),獲得去泛素化的IL-24突變體,為臨床應(yīng)用去泛素化IL-24突變體治療惡性腫瘤奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.利用基因定點(diǎn)突變技術(shù),以pcDNA3.1(+)-IL-24為模板,將IL-24第63、69、78、119、123、136、179、189、203、206潛在的泛素結(jié)合位點(diǎn)的賴氨酸密碼子突變成精氨酸密碼子,測(cè)序鑒定正確,從而構(gòu)建10個(gè)IL-24的突變體質(zhì)粒。
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2、.pcDNA3.1(+)-IL-24及10個(gè)IL-24突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞株Hela和人肝癌細(xì)胞株HepG2,以沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照,48小時(shí)后裂解細(xì)胞收集蛋白,以IL-24抗體作為一抗做Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)IL-24蛋白表達(dá)。
　　 3.pcDNA3.1(+)-IL-24及10個(gè)IL-24突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,以沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照,48小時(shí)后裂解細(xì)胞,細(xì)胞裂解液與IL-2

3、4一抗共孵育,用A/G Plus-Agarose珠子吸附結(jié)合有IL-24的蛋白質(zhì),接著進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),使用泛素一抗檢測(cè)泛素化IL-24蛋白;另將細(xì)胞裂解液與泛素一抗共孵育,用A/G Plus-Agarose珠子吸附結(jié)合有泛素的蛋白質(zhì),接著進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),使用IL-24一抗檢測(cè)泛素化IL-24蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 1.DNA測(cè)序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了10個(gè)IL-24突變體。
　

4、　 2.質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-24蛋白表達(dá),相對(duì)灰度值分析結(jié)果表明IL-24的第五個(gè)突變體(第123位賴氨酸密碼子突變?yōu)榫彼崦艽a子)表達(dá)的IL-24蛋白量顯著高于pcDNA3.1(+)-IL-24表達(dá)的IL-24蛋白,其余各突變體表達(dá)的IL-24蛋白量與pcDNA3.1(+)-IL-24比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后,免疫沉

5、淀-Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)泛素化IL-24蛋白,相對(duì)灰度值分析結(jié)果表明IL-24的第五個(gè)突變體表達(dá)的泛素化IL-24蛋白量顯著低于pcDNA3.1(+)-IL-24表達(dá)的泛素化IL-24蛋白,其余各突變體表達(dá)的泛素化IL-24蛋白量與pcDNA3.1(+)-IL-24比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建IL-24的10個(gè)突變體,DNA測(cè)序結(jié)果顯示突變成功。
　　 2.IL-24的第123