PLAG1和PLA2G2A在肝癌中的異常表達.pdf

1、背景與目的：
　　 肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma， HCC，簡稱肝癌)位居惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，死亡率第3位，其中一半以上病例發(fā)生于中國。肝癌起病隱匿，進展迅速，轉(zhuǎn)移快，死亡率高，對我們的生命健康造成了很大威脅。近些年人們大多認為肝癌的發(fā)生是多途徑、多因素、多階段長期作用的結(jié)果。目前已知的導(dǎo)致肝癌發(fā)生的相關(guān)因素包括外部促癌因素（感染HBV、HCV、細菌和寄生蟲，藥物，攝入黃曲霉毒素，飲酒，非酒精性

2、脂肪肝，膽管疾病與肝硬化等）和患者自身遺傳因素，其中HBV感染尤為重要。它們可損傷肝組織，使肝細胞異常增生，嚴重損壞肝臟實質(zhì)結(jié)構(gòu)和膽管系統(tǒng)，直接或間接地導(dǎo)致肝癌發(fā)生。
　　 目前治療肝癌的首選治療方法是外科手術(shù)切除，它聯(lián)合應(yīng)用TACE、射頻消融術(shù)、放療和中醫(yī)療法等，可明顯提高肝癌患者的5年生存率，而肝移植和生物治療是其新熱點。肝癌的發(fā)生發(fā)展過程很復(fù)雜，常同時存在原癌基因突變、抑癌基因缺失、細胞周期調(diào)控與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、免疫相關(guān)

3、基因和DNA修復(fù)基因的異常表達等。分子生物學(xué)研究正為肝癌的早期診斷與分子靶向治療尋求新的突破。最早發(fā)現(xiàn)且應(yīng)用最廣泛的血清腫瘤標志物是AFP(α-fetoprotein)，然而它的假陰性率大于30％，當前尚無任何標志物可診斷所有肝癌，我們需要通過聯(lián)合檢測來提高肝癌的早期檢出率，因此發(fā)現(xiàn)新的標志物有重大意義。
　　 前期通過運用寡核苷酸芯片篩選出肝癌和肝硬化差異基因表達譜，發(fā)現(xiàn)多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma

4、 gene1， PLAG1)在肝癌中是一個明顯高表達的基因，而ⅡA分泌型磷脂酶A2(groupⅡA secretory PhospholipaseA2， PLA2G2A)基因是一個明顯低表達的基因。PLAG1位于人類染色體8q12，已發(fā)現(xiàn)在腮腺多形性腺瘤、脂母細胞瘤等多種腫瘤中異常表達，其可通過激活靶基因促進細胞增殖引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PLA2G2A屬磷脂酶A2家族中的一種，已發(fā)現(xiàn)PLA2G2A在抗菌、炎癥反應(yīng)和抑制腫瘤等方面起重要作用

5、，在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達。
　　 通過應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，蛋白免疫印跡(Western blot)與免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)方法檢測PLAG1、PLA2G2A在人正常肝臟、肝硬化和肝癌組織中的表達情況，分析PLAG1及PLA2G2A在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，旨在為肝癌早期診斷和分子靶向治療找出理想的候選基因。
　　 材料與方法：
　　 正

6、常肝組織19例，肝硬化組織15例，肝癌組織39例，均取自河南省人民醫(yī)院2010年3月-2010年5月肝臟手術(shù)切除標本。正常肝組織乙肝表面抗原陰性，肝硬化、肝癌組織乙肝表面抗原均陽性，診斷均經(jīng)病理證實。
　　 按照Simply P總RNA提取試劑盒操作步驟分別提取標本中總RNA，按RT-PCR試劑盒操作程序行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并對PLAG1和PLA2G2A擴增產(chǎn)物進行掃描和半定量分析。
　　

7、 Tricine-SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉后一抗孵育，二抗稀釋液孵育，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。各組標本均常規(guī)HE染色，經(jīng)病理學(xué)分級，運用SP法行免疫組織化學(xué)檢測，用顯微掃描成像系統(tǒng)拍照、儲存圖片。
　　 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行成組設(shè)計資料的單因素方差分析后LSD-t檢驗、x2檢驗和Fisher's精確檢驗及Kruskal-Wallis秩和檢驗的統(tǒng)計學(xué)處理，以α=0.05為檢驗水準。
　　 結(jié)果

8、：
　　 1．電泳結(jié)果證明已提取了高純度的RNA，目的基因條帶清晰，內(nèi)參基因條帶明亮。
　　 2．RT-PCR和Western blot實驗表明：PLAG1mRNA和蛋白在肝癌中均呈上調(diào)表達，肝癌組、肝硬化組和正常組PLAG1 mRNA陽性表達率分別為：87.2％、46.7％和26.3％；三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=22.47，P(0.01)。PLAG1蛋白陽性表達率分別為：84.6％、40.0％和15.8％，三組間差

9、異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=27.15，P＜0.01）。PLA2G2A mRNA和蛋白在肝癌中均呈下調(diào)表達，肝癌組、肝硬化組和正常組PLA2G2A mRNA陽性表達率分別為：28.2％，66.7％和89.5％；三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=20.83，P＜0.01）。PLA2G2A蛋白陽性表達率分別為：25.6％，73.3％和84.2％，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=21.41，P＜0.01)。RT-PCR與Western blot結(jié)果一致。

10、
　　 3．免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果表明：不同分化程度（x2=13.75，P＜0.01）和不同病理分級（x2=24.23，P＜0.01）的HCC組織PLAG1表達強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義。肝癌組織分化程度越低，Edmondson分級程度越高，PLAG1表達程度越高。
　　 結(jié)論：
　　 1．在mRNA及蛋白水平上，PLAG1在肝癌組織中呈高程度的表達，說明PLAG1可能在肝癌形成的過程中起著非常重要的作用。PLA2G2A