四種遺傳性骨病的基因診斷與產(chǎn)前診斷.pdf

1、遺傳性骨病是一大類臨床和遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)的骨軟骨發(fā)育不良疾病,常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)包括矮身材、畸形、不成比例生長(zhǎng)以及單個(gè)或一組骨骼發(fā)育不良,主要有軟骨發(fā)育不全(ACH)、脊柱骨骺發(fā)育不良(SED)、多發(fā)性骨骺發(fā)育不全(MED)等疾病。遺傳性骨病的致病基因主要包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)、Ⅰ型膠原(COL1A1)、Ⅱ型膠原(COL2A1)等。本研究對(duì)遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良(SEDT,MIM271600)、軟骨發(fā)育不全(ACH,MIM

2、100800)、成骨不全(OI,MIM166200)以及先天性脊柱骨骺發(fā)育不良(SEDC,OMIM183900)等遺傳家系進(jìn)行研究,在明確其臨床診斷的基礎(chǔ)上,檢測(cè)致病基因,為疾病的基因診斷、產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢以及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究分為三部分:第一部分報(bào)告1個(gè)涉及5代63人6例遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良(spondyloepipbtyseal dysplasia tarda,SEDT)患者的家系,臨床特征主要為短軀

3、干性侏儒和脊柱側(cè)彎,X線表現(xiàn)為腰椎體前部上下緣凹陷,中后部呈駝峰狀突起等。分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的基因突變位點(diǎn),豐富了SEDT的基因型-表型譜,并探討基因突變致選擇性剪接的可能機(jī)制。
　　 方法:針對(duì)SEDL基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行序列分析與比對(duì)。提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA,RT-PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄本,克隆測(cè)序并進(jìn)行序列分析與比對(duì)。
　　 結(jié)果:基因組DNA測(cè)序結(jié)果顯示,家系中所有患者SEDL基因exon3均

4、發(fā)生突變(c.61 G>T,p.Glu21stop),所有攜帶者均為雜合突變,家系中其他成員及400例正常對(duì)照中均未見(jiàn)該突變,提示SEDL基因c.61 G>T突變是導(dǎo)致該SEDT家系患者發(fā)病的原因。檢索基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表文獻(xiàn)顯示c.61 G>T突變是SEDL基因新的突變位點(diǎn)。SEDL基因cDNA測(cè)序亦發(fā)現(xiàn)c.61 G>T突變,證實(shí)了DNA測(cè)序結(jié)果。有趣的是,RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者和攜帶者均存在兩種轉(zhuǎn)錄本,較長(zhǎng)者為正常大小的轉(zhuǎn)錄

5、本,較短者缺失了112bp(c.-19-c.93 del)。生物信息學(xué)分析顯示,SEDL基因c.61 G>T突變后產(chǎn)生3個(gè)剪接抑制子。
　　 結(jié)論:SEDL基因c.61 G>T突變是一新突變方式,詳細(xì)的臨床與分子遺傳學(xué)研究豐富了SEDT的基因型.表型譜。SEDL基因突變結(jié)果對(duì)攜帶者檢測(cè)、癥狀前診斷以及患者和攜帶者的產(chǎn)前基因診斷具有重要意義。SEDL基因c.61 G>T(p.Glu21stop)突變可能激活了潛在可變剪接調(diào)控元件,

6、抑制了exon3的剪接,轉(zhuǎn)錄本跳躍exon3產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄變異體。該基因突變致選擇性剪接的分子機(jī)制及生物學(xué)效應(yīng)值得進(jìn)一步研究。
　　 第二部分報(bào)告了3例散發(fā)的軟骨發(fā)育不全(achondroplasia,ACH)病例,臨床主要表現(xiàn)為身材矮小不成比例,短而粗的三叉手,X線特征為腰椎椎弓根間距進(jìn)行性狹窄,管狀骨短。進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究,為ACH的產(chǎn)前分子診斷奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:針對(duì)FGFR3基因突變位點(diǎn)exon10片段設(shè)計(jì)引物,P

7、CR擴(kuò)增,并進(jìn)行序列分析與比對(duì)。
　　 結(jié)果:3例患者.FGFR3基因均發(fā)生c.1138 G>A雜合突變,導(dǎo)致氨基酸發(fā)生Gly380Cys改變。其中1例已妊娠11周,等待進(jìn)行產(chǎn)前分子診斷。
　　 結(jié)論:3例患者均由于FGFR3基因發(fā)生c.1138 G>A突變導(dǎo)致ACH,明確了ACH臨床診斷,為產(chǎn)前分子診斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第三部分研究膠原基因COL1A1和COL2A1突變所致疾病的基因診斷與產(chǎn)前診斷。報(bào)告1

8、例成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)患者,并進(jìn)行Ⅰ型膠原基因突變篩查,OI臨床表現(xiàn)為骨脆性增加,藍(lán)鞏膜,易骨折,X線表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松,長(zhǎng)骨皮質(zhì)菲薄,骺端膨大。另外,對(duì)1例Ⅱ型膠原COL2A1基因G504S突變致先天性脊柱骨骺發(fā)育不良(spondylepiphyseal dysplasia congenita,SEDC)患者的妻子進(jìn)行產(chǎn)前分子診斷,避免患兒出生。SEDC臨床特征為身材矮小,短頸、跛行,手部正常,

9、X線特征為扁平椎體、脊柱側(cè)彎、股骨頭骨化缺如等。
　　 方法:針對(duì)COL1A1基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行序列分析與比對(duì)。SEDC患者妻子于20孕周在B超引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜囊穿刺,抽取羊水10ml,提取羊水細(xì)胞基因組DNA。選擇3個(gè)多態(tài)性STR位點(diǎn),即D3S1358、D16S539和D21S11,排除母體細(xì)胞污染。在此基礎(chǔ)上,對(duì)COL2A1基因exon23進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物進(jìn)行正、反向測(cè)序。
　　 結(jié)果:OI患者

10、COL1A1基因exon45發(fā)生c.3263 G>A(p.Gly1088Glu)雜合突變,其父母、妹妹以及250例正常對(duì)照均未見(jiàn)該突變,提示COL1A1基因c.3263 G>A是該OI患者的遺傳基礎(chǔ)。檢索基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表文獻(xiàn)顯示c.3263 G>A突變是COL1A1基因新的突變位點(diǎn)。進(jìn)行SEDC產(chǎn)前分子診斷的胎兒COL2A1基因exon23正常,未帶有與父親相同的突變,且胎兒產(chǎn)前分子診斷結(jié)果與B超監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論