核酸疫苗免疫機制的研究.pdf

1、DNA疫苗又稱核酸疫苗、基因疫苗,是近年來隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型疫苗。由于DNA疫苗本身既有類似減毒活疫苗的優(yōu)點,又有滅活疫苗或亞單位疫苗的安全性,不僅具有預(yù)防疾病的作用,同時還具有治療疾病的作用。所以治療性核酸疫苗成為近些年研究的重點,并迅速地從治療傳染性疾病的研究擴展到非傳染性疾病的研究。感染疾病預(yù)防性和腫瘤治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快,而且有相當(dāng)數(shù)量的臨床實驗正在進行。盡管DNA疫苗得到了快速而廣泛的發(fā)展,但其總

2、的免疫效果還不盡如人意。有的DNA疫苗在小動物實驗中免疫效果很好,在大動物實驗中效果欠佳；有的DNA疫苗在動物實驗中能起到很好的免疫保護作用,但在臨床試驗中卻不能保護受試者抵抗病原體的攻擊。為了能解決DNA疫苗應(yīng)用中的這些問題,新的用于增強DNA疫苗的研究策略層出不窮,但任何策略都是建立在對疫苗作用機制深刻認識的基礎(chǔ)上,而關(guān)于DNA疫苗的免疫機制目前尚不十分清楚。為了深入研究DNA疫苗的免疫機制,我們選擇了兩種疾病展開研究,一種是阿爾茨

3、海默氏病(AD),另一種是乙肝病毒(HBV)相關(guān)的原發(fā)性肝細胞癌(HCC)。 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)元退行性變疾病,是引起老年期癡呆最主要的原因。眾所周知B淀粉樣蛋白(Aβ)在腦內(nèi)沉積形成的老年斑(senile plaque,SP)是引起AD發(fā)病最主要的因素,減少Aβ淀粉樣蛋白沉積的形成,是預(yù)防和治療AD的一種新措施。繼Schenk等人成功的用Aβ疫苗對PDAPP小鼠進行免疫治療之

4、后,一些動物實驗均發(fā)現(xiàn)該疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生有效治療濃度的抗Aβ抗體,使Aβ沉淀減少,并改善動物的認知行為學(xué)表現(xiàn)。但在臨床Ⅱ期試驗中出現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和卒中,這些不良反應(yīng)促使人們對Aβ疫苗的應(yīng)用和機制更深入地去研究。也使我們研制具有Aβ免疫原性而又不具有其毒副作用的Aβ DNA疫苗勢在必行。我們前期工作中采用Aβ表位疫苗和Aβ全長DNA疫苗免疫小鼠,不與任何佐劑聯(lián)用時,Aβ全長DNA疫苗與其中一組Aβ表位疫苗能誘發(fā)有效的體液免疫,但

5、抗體滴度不理想?？紤]到DNA疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強度與基因表達效率(即每個被轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)抗原基因的表達量)呈正相關(guān),可以嘗試通過改變胞內(nèi)定位,使之分泌到胞外來改變目的蛋白的免疫原性。本實驗選用了TPA信號肽序列與AB42融合表達,體內(nèi)實驗證明,含有TPA信號肽序列與Aβ42融合基因的DNA疫苗組所誘發(fā)的特異性抗Aβ抗體滴度高于僅含Aβ42全長基因DNA疫苗組。在細胞內(nèi)表達Aβ/GFP和TPA-Aβ/GFP融合蛋白,發(fā)現(xiàn)TPA-Aβ在細胞

6、質(zhì)和胞核中均勻表達并于72h少量集中分布于細胞膜上,提示我們目的蛋白正處于分泌表達狀態(tài)。進一步實驗證實了在融合基因TPA-AB/GFP轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)存在目的蛋白。上述實驗結(jié)果提示我們,利用TPA信號肽成功地將AB引導(dǎo)穿過細胞膜,達到分泌表達,從而增強抗原遞呈細胞的攝取,提高機體免疫系統(tǒng)免疫活性,產(chǎn)生較高滴度的抗體水平。為我們下一步改造AB表位疫苗,使之具有更強的免疫原性,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更強的體液免疫,進一步探討利用DNA疫苗主

7、動免疫清除老年斑的作用機制奠定了基礎(chǔ)。 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染和原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCc)相關(guān)率高達80％,HBV感染者發(fā)生HCC的危險性是無感染者的200余倍。HBV是HCC的重要誘因這一結(jié)論已被科學(xué)界廣泛接受,但其具體機制尚不明確。近年來,隨著對HBx生物學(xué)功能研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)HBx在此過程中發(fā)揮了重要作用。X基因是HBV基因組最小的開

8、放讀碼框,它編碼的X蛋白含154個氨基酸,分子量約為16.5 kD。HBx是一種多功能的病毒調(diào)節(jié)因子,大量研究資料顯示HBx參與基因轉(zhuǎn)錄,DNA修復(fù),活化多種信號傳導(dǎo)通路。這些效應(yīng)以及它們在細胞凋亡和增殖中綜合作用的結(jié)果,可以初步解釋HBV導(dǎo)致HCC的機制。但HBx促癌變的確切機制至今尚未闡明,可能通過多種途徑起作用,十分復(fù)雜,一些研究結(jié)果又互相矛盾,因此,有必要對其分子機制進行深入研究,在此基礎(chǔ)上才有可能構(gòu)建相應(yīng)的治療性DNA疫苗防治

9、這種與病毒相關(guān)的腫瘤。X蛋白不能同雙鏈DNA直接結(jié)合,而是通過細胞內(nèi)蛋白間的相互作用啟動一系列磷酸化和去磷酸化過程,從而上調(diào)眾多基因的表達。為了尋找并鑒定X蛋白直接或間接作用的蛋白,進一步闡明其機理,本實驗以成人肝癌細胞HepG2為研究對象,將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-X瞬時轉(zhuǎn)染入細胞中,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)尋找并鑒定了實驗組和對照組的8個差異表達蛋白。其中,上調(diào)表達的蛋白STRAP、nm23-H1和下調(diào)表達蛋白PIMT與PBK信號