Oct-4在骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)分化中的甲基化研究.pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mouse Bone marrow mesenchymal stem cells，mBMSCs），并誘導(dǎo)其向成骨細胞方向分化，檢測Oct-4在mBMSCs誘導(dǎo)分化前后的表達及甲基化狀態(tài)的改變，為進一步研究Oct-4在BMSCs增殖分化中的作用提供研究思路。 方法：采用全骨髓貼壁篩選法體外培養(yǎng)、擴增mBMSCs。用CD29、CD44、c-Kit以及CD34免疫細胞化學(xué)染色鑒定mBMSCs。

2、取第3代小鼠BMSCs，用含10％FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/ml維生素C和10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)mBMSCs向成骨細胞分化，并用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）染色、茜素紅染色等方法進行鑒定，同時用體外分離培養(yǎng)的成骨細胞作陽性對照。采用RT-PCR及間接免疫熒光染色方法，從mRNA和蛋白水平檢測Oct-4在mBMSCs成骨誘導(dǎo)分化前后的表達；運用甲基化

3、特異PCR檢測Oct-4在mBMSCs誘導(dǎo)分化前后的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：mBMSCs接種24h后已大量貼壁并伸展開；48h后貼壁細胞明顯增多并分裂增殖，貼壁細胞呈梭形或成纖維細胞樣形態(tài)。傳代培養(yǎng)后，細胞形態(tài)更加均一，增殖加快，呈渦旋樣生長。免疫細胞化學(xué)染色和間接免疫螢光染色結(jié)果顯示第3代mBMSCs CD29、CD44、c-Kit表達陽性，CD34表達陰性。第3代mBMSCs在成骨誘導(dǎo)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4天后細胞形態(tài)變化，隨著誘導(dǎo)時間的

4、延長，細胞逐漸增大，細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎嘟切?。mBMSCs誘導(dǎo)10d后大多數(shù)細胞和體外培養(yǎng)成骨細胞形態(tài)相似，均呈AKP和茜素紅陽性反應(yīng)。RT-PCR結(jié)果與間接免疫熒光染色結(jié)果同時顯示，第3代的mBMSCs有Oct-4表達，而向成骨方向誘導(dǎo)10d后的mBMSCs及小鼠成骨細胞均未見Oct-4表達；MSP結(jié)果顯示，mBMSCs在向成骨方向誘導(dǎo)10天后，Oct4基因的啟動子區(qū)的CpG島出現(xiàn)甲基化，而朱誘導(dǎo)的第3代mBMSCs為非甲基化狀