結(jié)核分支桿菌耐異煙肼分子機理及其耐藥基因檢測方法的研究.pdf

1、異煙肼(INH)是主要的一線抗結(jié)核藥物之一，結(jié)核分支桿菌耐異煙肼直接影響化療的成功率。大量研究認為，INH實際上是一種藥物前體，需經(jīng)結(jié)核分支桿菌過氧化氫酶—過氧化物酶氧化為尼克酸的類似物—異煙酸，參與輔酶Ⅰ的合成而發(fā)揮抗菌作用。結(jié)核分支桿菌katG基因含4795個核苷酸，編碼過氧化氫酶—過氧化物酶。若katG基因缺失或突變，使過氧化氫酶—過氧化物酶活性喪失或降低，阻止INH轉(zhuǎn)化成活性形式，就會導(dǎo)致結(jié)核分支桿菌耐INH。 目的：闡

2、明結(jié)核分支桿菌耐INH的分子機制及建立其耐藥基因的檢測方法。 方法：通過聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法對60株臨床分離株經(jīng)16SrRNA基因進行初步的分子菌種鑒定，對58株結(jié)核分支桿菌進行了傳統(tǒng)藥物敏感性試驗；以結(jié)核分支桿菌標準菌株H37Rv做對照，通過PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法分析58株結(jié)核分支桿菌分離株katG273bp片段和inhA255bp片段；PCR直接測序法(PCR-DS)分析。

3、 結(jié)果：160株臨床分離株中2株為非結(jié)核分支桿菌，余58株為結(jié)核分枝桿菌，其圖譜均與結(jié)核分支桿菌標準菌株SSCP圖譜相同。對58株結(jié)核分支桿菌進行了傳統(tǒng)藥物敏感性試驗，結(jié)果18株為INH敏感株，40株為耐INH菌株。對40株結(jié)核分支桿菌耐INH分離株和18株INH敏感株分別進行katG和inhA基因擴增，產(chǎn)生273bp和255bp片段。katG和inhA擴增引物的敏感性均為100pg，特異性標準為結(jié)核分支桿菌復(fù)合群。 2

4、以結(jié)核分支桿菌標準菌株H37Rv做對照，通過PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法分析58株結(jié)核分支桿菌分離株katG273bp片段和inhA255bp片段，其中18株INH敏感株中有5株(27.8％)出現(xiàn)katG擴增產(chǎn)物泳動變位，PCR直接測序法(PCR-DS)分析，1株315位AGC→AAC突變，4株315位AGC→ACC突變；18株INH敏感侏中有3株(16.7％)出現(xiàn)inhA泳動變位。40株耐INH菌株中，29株(72.5％)k

5、atG基因SSCP圖譜與結(jié)核分支桿菌標準株不同，PCR-DS分析為katG315位AGC→ACC突變；10株(25％)inhA基因SSCP圖譜與標準株不同。對3株SSCP異常的INH敏感株和4株泳動異常的耐INH結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行inhA基因PCR-DS分析，結(jié)果均為inhA基因-15位C→T突變。 3影響SSCP分析的因素很多，本文對PCR-SSCP方法的實驗條件進行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果顯示采用8％(29∶1)非變性聚丙

6、烯酰胺凝膠在120V穩(wěn)壓下電泳6～8小時效果較理想。 結(jié)論：1.結(jié)核分支桿菌katG基因和inhA基因突變是耐INH產(chǎn)生的主要原因。 2.通過PCR-SSCP方法檢測結(jié)核分支桿菌臨床分離株，耐INH菌株中katG基因突變檢出率為72.5％，inhA基因突變檢出率為25％。 3.16SrRNAPCR-SSCP方法能夠簡便、快速地將臨床分離株鑒定為結(jié)核分支桿菌復(fù)合群或非結(jié)核分支桿菌。 4.PCR擴增結(jié)核分支桿