分子伴侶Grp78對肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、[研究背景與目的]： 肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上第五大常見腫瘤，每年死于HCC患者人數(shù)超過500，000例。近年來HCC的治療理念、策略、模式、技術(shù)乃至醫(yī)療組織結(jié)構(gòu)都經(jīng)歷了重大演變。盡管多?？坪投嘣委熌Ｊ斤@著改變了HCC的治療效果，但HCC治療仍然面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。早期發(fā)生的門靜脈侵襲和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，是肝癌病人手術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差的最重要原因之一．目前肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制還不很清楚，因此探索腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制、尋找抑制腫

2、瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分泌的一種多功能蛋白質(zhì)，對于折疊，成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)到細(xì)胞外發(fā)揮重要的作用。許多研究表明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中伴隨著Grp78表達(dá)和功能的改變。最近的研究揭示了Grp78在轉(zhuǎn)移腫瘤表面表達(dá)，并且增高的Grp78表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)，這表明Grp78在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 本研究旨在應(yīng)用免疫組織化學(xué)方

3、法在人肝細(xì)胞癌組織中檢測Grp78，F(xiàn)AK的表達(dá)，并應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)Grp78在肝癌細(xì)胞株BEL7402中的表達(dá)，探討Grp78在肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制。 [實(shí)驗(yàn)方法]： 一、肝癌組織中Gap78和FAK表達(dá)的相關(guān)性研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測44例人肝細(xì)胞癌手術(shù)切除組織中Grp78，F(xiàn)AK的表達(dá)及tyr397的磷酸化情況。每個(gè)組織標(biāo)本取3張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)

4、行觀察、評分，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 二、特異性下調(diào)Grp78對肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響通過siRNA技術(shù)特異性下調(diào)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEL7402中Grp78的表達(dá)，應(yīng)用Transwell法和劃痕法對肝細(xì)胞癌侵襲，轉(zhuǎn)移能力的改變進(jìn)行分析；應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)和GST-pulldown技術(shù)分別對FAK的磷酸化水平和小GTPase RhoA的活性進(jìn)行研究；應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測E-鈣黏素，N-鈣黏素和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。 三

5、、特異性下調(diào)Grp78抑制肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制通過siRNA技術(shù)特異性下調(diào)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEL7402中Grp78的表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)觀察特異性下調(diào)Grp78對細(xì)胞黏附特性和細(xì)胞極性形成的影響；應(yīng)用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性；用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄因子c-jun的表達(dá)及磷酸化狀態(tài)． [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]： 一

6、、肝癌組織中Grp78和FAK表達(dá)的相關(guān)性研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測44例人肝細(xì)胞癌組織中Grp78、FAK的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Grp78、FAK表達(dá)與肝癌細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)(r=0.456，P=0.001；r=0.312，P=0.039)。研究結(jié)果還顯示在44例肝細(xì)胞癌中Grp78和FAK呈正相關(guān)(r=0.434，p=0.001)。 anti-FAK-p-tyr397抗體免疫組織化學(xué)方法檢測人肝細(xì)胞癌中FAK的活性，結(jié)

7、果表明FAK-p-tyr397染色強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞的分化程度不相關(guān)，Grp78的表達(dá)和磷酸化FAK不相關(guān)。 二、特異性下調(diào)Grp78對肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞每個(gè)低倍視野細(xì)胞數(shù)平均為83個(gè)，明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(平均210個(gè)胝倍視野)和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(平均220個(gè)/低倍視野)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明具有顯著性差異(P＜0.05)．這表明特異性下調(diào)Grp78可以抑制肝細(xì)胞癌的

8、侵襲。 劃痕法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24h后Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的創(chuàng)口愈合較慢(53％)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(92％)和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(94％)創(chuàng)口基本愈合。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明具有顯著差異(p＜0.05)． 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Crp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FAK的磷酸化水平明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著差異(p＜0.05)；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染

9、細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，F(xiàn)AK的表達(dá)沒有差異(p＞0.05)．以上結(jié)果表明特異性下調(diào)Grp78表達(dá)可以抑制FAK的磷酸化。 GST pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，RhoA-GTP(活性形式)的水平明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，這表明特異性下調(diào)Grp78可以促進(jìn)RhoA的活化；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞

10、和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，RhoA的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中N-鈣黏素、波形蛋白的表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而E-鈣黏素的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(p＜0.05)。 三、特異性下調(diào)Grp78抑制肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制應(yīng)用細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)對Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的極性形成進(jìn)行研究，結(jié)果表明在不同時(shí)間點(diǎn)Gr

11、p78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的伸展明顯落后于非特異性RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(p＜0.05)． 應(yīng)用明膠酶譜技術(shù)和免疫印跡技術(shù)對Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)與活性進(jìn)行檢測，明膠酶譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2、MMP-9的活性明顯低于非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)明顯低于非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)

12、染細(xì)胞。 應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子c-jun的表達(dá)及磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Grp78-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，c-jun的磷酸化水平明顯降低，而c-jun的表達(dá)沒有變化。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)論]： 1.在人肝細(xì)胞癌組織中Grp78和FAK的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)；FAK-p-tyr397的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的分化程度不相關(guān)； 2.Grp78在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與FAK的表達(dá)呈正相關(guān)； 3.特異性下