PTSD中縫背核ERS分子伴侶GRP78及跨膜蛋白ATF6α通路應(yīng)答UPR的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Posttraumatic stress disorder，PTSD)指的是對(duì)戰(zhàn)爭(zhēng)等嚴(yán)重應(yīng)激源的一種心理、生理異常反應(yīng)，其在臨床上的核心癥狀主要有反復(fù)重現(xiàn)創(chuàng)傷性體驗(yàn)、警覺性增高、持續(xù)性回避及認(rèn)知、情緒的負(fù)性改變。近些年隨著自然災(zāi)害、重大交通事故及社會(huì)暴力等事件的不斷增多，PTSD發(fā)生率也不斷上升，并逐漸成為影響我國人口素質(zhì)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的沉重社會(huì)負(fù)擔(dān)，頗得國內(nèi)外高度關(guān)注。盡管目前對(duì)PTSD開展了大量研究，但其確切發(fā)病機(jī)制至今

2、尚不十分清楚。大量臨床及藥理學(xué)研究報(bào)道，PTSD患者血漿及大腦中縫背核(Dorsal raphe nucleus)5-羥色胺（5-HT）水平較健康人群顯著降低，而給予5-HT重?cái)z取抑制劑(SSRIs)可顯著改善PTSD患者癥狀。這表明大腦中縫背核5-HT系統(tǒng)參與了PTSD的發(fā)病，大腦中縫背核功能失調(diào)是引起PTSD的可能發(fā)病機(jī)制之一。
　　我們前期研究證實(shí)PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元存在鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)如鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白激酶等表

3、達(dá)異常，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)存及蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鈣離子平衡紊亂、蛋白質(zhì)合成障礙等異常時(shí)，可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。這啟發(fā)我們ERS-UPR可能參與了PTSD發(fā)病，是導(dǎo)致PTSD中縫背核功能失調(diào)的重要機(jī)制。
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白

4、(glucose regulated protein78，GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶，在ERS-UPR的啟動(dòng)中發(fā)揮了重要作用。在非應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78與ATF6α等3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)跨膜蛋白相結(jié)合，協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊與轉(zhuǎn)運(yùn);發(fā)生ERS時(shí)，GRP78與跨膜蛋白解離并啟動(dòng)UPR各信號(hào)通路以緩解應(yīng)激、恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。而若刺激強(qiáng)度過大、持續(xù)時(shí)間過長，UPR不能有效緩解ERS時(shí)，UPR信號(hào)通路將最終上調(diào)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CHO

5、P)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)細(xì)胞凋亡以清除受損細(xì)胞。
　　目的：
　　大量文獻(xiàn)研究證實(shí)ERS-UPR機(jī)制參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展，如腦缺血缺氧、糖尿病、阿爾茨海默病等，但至今為止PTSD發(fā)病中ERS-UPR應(yīng)答情況的研究較少見，且處于起步階段。本研究采用國際公認(rèn)的PTSD動(dòng)物模型即單一延長應(yīng)激(single prolonged stress，SPS)模型，通過免疫組織化學(xué)、Western blot、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT

6、-PCR)、透射電鏡等技術(shù)以探討PTSD中縫背核分子伴侶GRP78與跨膜蛋白ATF6α通路對(duì)UPR的應(yīng)答，以期為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、PTSD中縫背核ERS分子伴侶GRP78應(yīng)答UPR的實(shí)驗(yàn)研究
　　將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組與模型組。模型組采用單一連續(xù)刺激(singleprolonged stress，SPS)方法建立PTSD大鼠模型，并隨機(jī)分為SPS刺激后1d、7d

7、和14d組。采用透射電鏡技術(shù)觀察PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)改變，并采取免疫組織化學(xué)SABC法、Western blot方法檢測(cè)PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子伴侶GRP78及GRP94表達(dá)。
　　二、PTSD中縫背核ERS跨膜蛋白ATF6α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究
　　將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組與模型組。模型組采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，并隨機(jī)分為SPS刺激后1d、7d和14d組。采用免

8、疫組織化學(xué)SABC法、Western blot方法檢測(cè)ATF6α蛋白表達(dá);采用RT-PCR方法檢測(cè)ATF6α及其下游靶基因XBP1、GRP94 mRNA改變。
　　三、PTSD中縫背核CHOP與細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組與模型組。模型組采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，并隨機(jī)分為SPS刺激后1d、7d和14d組。采用免疫組織化學(xué)、Westernblot方法檢測(cè)CHOP蛋白表達(dá);采用RT-P

9、CR技術(shù)觀察CHOPmRNA改變;采用透射電鏡技術(shù)觀察中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果：
　　一、PTSD中縫背核ERS分子伴侶GRP78應(yīng)答UPR的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)改變
　　SPS刺激后第7d組大鼠中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔出現(xiàn)了擴(kuò)張改變。
　　2、GRP78、GRP94免疫組化分析結(jié)果
　　GRP78、GRP94的免疫陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒，主要定位于胞

10、漿中。SPS刺激后GRP78、GRP94陽性表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，尤其以SPS刺激后第7天顯著(P＜0.01)，隨后稍微降低，但也顯著較正常對(duì)照組增多(P＜0.01)。
　　3、GRP78、GRP94 Western blot檢測(cè)結(jié)果
　　SPS刺激后GRP78蛋白顯著增加，7d時(shí)表達(dá)最多，之后逐漸減少，但仍明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。GRP94蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與GRP78一致，SPS刺激后逐漸

11、表達(dá)增加，7d達(dá)峰值，隨后降低。
　　二、PTSD中縫背核ERS跨膜蛋白ATF6α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、ATF6α免疫組化分析結(jié)果
　　ATF6α蛋白定位在胞漿，陽性表達(dá)呈棕黃色。經(jīng)SPS刺激后第1d，ATF6α陽性表達(dá)稍有增多，隨后逐漸減少，尤以SPS刺激后第14d顯著減少(P＜0.01)。
　　2、ATF6α Western blot檢測(cè)結(jié)果
　　ATF6α(p90 ATF6α)是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上

12、的跨膜蛋白，分子量為90kDa。經(jīng)SPS刺激后第7d、第14d p90 ATF6α表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。而在50kDa區(qū)域，出現(xiàn)清晰條帶(p50 ATF6α)且表達(dá)量持續(xù)增多(P＜0.01)。
　　3、ATF6α RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　經(jīng)SPS刺激后，ATF6α mRNA未見明顯改變(P＞0.05)。
　　4、XBP1、GRP94 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　經(jīng)SPS刺激后第1d，XBP1 mRNA有顯

13、著增多(P＜0.01)，隨后逐漸減少。GRP94 mRNA在SPS刺激后表達(dá)上調(diào)，在第7d達(dá)峰值(P＜0.01)，之后降低。
　　三、PTSD中縫背核CHOP與細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　經(jīng)SPS刺激后CHOP陽性表達(dá)較對(duì)照組顯著增多(P＜0.05)，尤以SPS刺激后第14d顯著增多(P＜0.01)
　　2、Western blot檢測(cè)結(jié)果
　　CHOP在正常大鼠中縫背核神經(jīng)元表達(dá)

14、低下，而經(jīng)SPS刺激后，CHOP表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，尤其以SPS刺激后第14d顯著增多(P＜0.01)。
　　3、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　正常組CHOP mRNA表達(dá)量相對(duì)較少;而經(jīng)SPS刺激后，CHOP mRNA逐漸增多(P＜0.05)，尤以SPS刺激后第14d顯著(P＜0.01)。
　　4、透射電鏡檢測(cè)結(jié)果
　　經(jīng)SPS刺激后，中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、半月狀改變。
　　結(jié)論：