未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)因子GRP78、ATF6和XPB1在食管鱗癌中的表達(dá)及其意義.pdf

1、背景與目的
　　食管癌(Esophagealcancinoma，EC)是常見的威脅人類生命健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）是主要病變發(fā)生在食管鱗狀上皮組織的食管惡性腫瘤，在中國約95％以上的食管癌病例為食管鱗狀細(xì)胞癌。目前而言，食管癌發(fā)病率、死亡率均較高。全世界每年新發(fā)病例人數(shù)約為40萬例，每年約有30萬人死于該病;中國屬于食管癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率

2、約為13/10萬，死亡率約為15萬/年。研究表明，早期食管癌患者若能及時(shí)、有效診療，其治療后5年生存率可達(dá)到90％以上;由于食管癌的發(fā)生發(fā)展過程呈逐漸演變性，早期癥狀并不明顯，加之早期篩查診斷等方面的缺失，入院首診多為中晚期病例，治療后5年生存率低于10％。目前針對(duì)食管癌的治療主要以手術(shù)、放療、化療以及生物治療等傳統(tǒng)腫瘤治療方法為主，雖然近年來伴隨食管癌診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，患者的生存率和生活質(zhì)量都有相應(yīng)的提高，但總體治療效果仍不理想。

3、因而現(xiàn)階段食管癌的研究主要集中在如何早期發(fā)現(xiàn)食管癌、尋找更有效的治療方式、提升治愈率及提高患者治療后生存質(zhì)量。
　　食管鱗狀細(xì)胞癌作為實(shí)體惡性腫瘤之一，也存在多步驟和多基因突變的發(fā)生、發(fā)展過程，同樣也與腫瘤的生長代謝與生長分?jǐn)?shù)、自身程序性死亡等因素均存在關(guān)聯(lián)。未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse，UPR)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)其中重要的一種類型，其可

4、能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。
　　實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長過程中因其失控性生長和增殖消耗大量的營養(yǎng)和氧氣，加之血供不足等原因，普遍存在著微環(huán)境缺氧、營養(yǎng)匱乏、PH改變等情況，在這種不良的環(huán)境影響下，可致組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成錯(cuò)誤折疊堆積，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的發(fā)生。未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)作為ERS中重要分支，是一種在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞反應(yīng)機(jī)制，通過抑制蛋白翻譯，誘導(dǎo)ERS內(nèi)伴侶蛋白分子合成，

5、增強(qiáng)蛋白折疊能力，促進(jìn)蛋白外輸和未折疊蛋白降解，以恢復(fù)ERS穩(wěn)態(tài)。這提升了腫瘤細(xì)胞生長過程中在有害因素下的生存能力，也可能是使腫瘤細(xì)胞惡性度提高并增加遷徙率的重要機(jī)制，同時(shí)持續(xù)或過度的UPR可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡死亡。目前已知，未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在著3條激活傳道通路:雙鏈RNA激活的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKRlikeERkinase，PERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;需肌醇酶1(type-1endoplasmicreticu

6、lumtransmembraneproteinkinase，IRE1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;活化轉(zhuǎn)錄因子6(activatingtranscriptionfactor6，ATF6)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。并由復(fù)雜的相關(guān)作用因子共同參與完成，其信號(hào)分子主要有GRP78、IRE1、ATF6、XBP1和PERK等。GRP78(glucoseregulatedproteinof78)為UPR最重要的伴侶蛋白和調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子，UPR過程中其轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，可被認(rèn)

7、為UPR激活的標(biāo)志分子;ATF6(activatingtranscriptionfactor6)是UPR過程中轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)激信號(hào)的重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，其活化直接導(dǎo)致UPR中ATF6通路下游元件轉(zhuǎn)錄激活，其激活情況可被用于明確UPR中ATF6通路激活情況;XBP1（Xbox-bindingprotein1）是UPR靶基因的激活因子，在UPR的IRE1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，IRE1(inositolrequiring1)對(duì)其特異性的剪切，將非剪接型XBP

8、1-u轉(zhuǎn)化為剪接型XBP1-s，從而提高其活性和引發(fā)下游效應(yīng)，因而非剪接型XBP1-u與剪接型XBP1-s的表達(dá)差異決定了UPR中IRE1通路激活情況。
　　目前已有相關(guān)研究證實(shí)，UPR在許多實(shí)體腫瘤，如乳腺癌、胃癌、肝癌、膽管癌、前列腺癌等中被激活，但ESCC組織中激活情況及其作用機(jī)制的研究并不完善。腫瘤細(xì)胞UPR在內(nèi)的ERS，作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)已經(jīng)普遍受到人們的重視，伴隨著ERS學(xué)說研究的不斷深入及完善，有望使我們更加充分

9、了解實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，從而提供新的實(shí)體腫瘤治療靶點(diǎn)及預(yù)防途徑。
　　本實(shí)驗(yàn)分別采用免疫組化SP及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptasePCR，RT-PCR)法檢測ESCC組織中GRP78、ATF6及XBP1的表達(dá)，并分析其在ESCC組織及正常食管組織中表達(dá)的差異及其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，探討ESCC組織中UPR存在情況及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系的意義。為食管癌的診斷及治療提供新的思路。<

10、br>　　對(duì)象與方法
　　1.收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科2011年11月至2013年9月間經(jīng)手術(shù)切除且經(jīng)病理證實(shí)的原發(fā)性ESCC組織及距癌組織5cm以上的手術(shù)遠(yuǎn)端切緣正常食管黏膜組織各99例，所有病例術(shù)前未經(jīng)放、化療治療。其中男性62例，女性37例;年齡38～73歲，≤60歲27例，＞60歲72例。分化程度:低分化32例，中分化53例，高分化14例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。
　　2.

11、應(yīng)用免疫組化SP的方法檢測99例食管鱗狀細(xì)胞癌組織及其相應(yīng)正常食管組織中GRP78和ATF6兩種蛋白的表達(dá)情況;應(yīng)用RT-PCR方法分析XBP1兩種不同的亞型（非剪接型XBP1-u，剪接型XBP1-s）在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及其相應(yīng)正常食管組織中表達(dá)分布情況;并分別分析GRP78、ATF6、XBP1-u、XBP1-s的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。
　　3.采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組定性資料之間的比較采用

12、x2檢驗(yàn)法進(jìn)行，GRP78及ATF6蛋白在ESCC組織和正常食管組織中表達(dá)情況對(duì)比采用配對(duì)x2檢驗(yàn);在ESCC組織不同病理特征因素中表達(dá)情況使用獨(dú)立樣本x2檢驗(yàn)進(jìn)行;兩組定量資料之間的比較采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行，XBP1-u及XBP1-smRNA在ESCC組織和正常食管組織中相對(duì)表達(dá)量采用配對(duì)t檢驗(yàn);XBP1-smRNA在ESCC組織中表達(dá)情況采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果
　　1.GRP78在99例ESCC

13、組織陽性表達(dá)高于正常食管組織，二者分別為67/99(67.7％)，37/99(37.4％)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　2.GRP78在高、中、低分化組的表達(dá)遞增，分別為6/14(42.9％)，35/53(66％)，26/32(81.3％)，三者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分別為26/30(86.7％)，41/69(59.4％)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

14、)。GRP78表達(dá)與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　3.ATF6在99例ESCC組織陽性表達(dá)高于正常食管組織，分別為62/99(62.6％)，35/99(35.6％)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　4.ATF6在高、中、低分化組的表達(dá)遞增，分別為5/14(35.7％)，32/53(60.4％)，25/32(78.1％)，三者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

15、組，分別為25/30(83.3％)，37/69(53.6％)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ATF6表達(dá)與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。
　　5.XBP1-smRNA在ESCC組織中表達(dá)高于正常食管組織，分別為0.446±0.033，0.217±0.018，二者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);
　　6.XBP1-smRNA在中、高分化組的表達(dá)低于低分化組，分別為0.437±0.035，0.450±0.041，兩者差異存在

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分別為0.448±0.040，0.436±0.032，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);。XBP1-smRNA表達(dá)與性別、年齡等因素?zé)o關(guān)(P＞0.05);
　　7.XBP1-umRNA在ESCC組織及正常食管組織中表達(dá)分別為0.191±0.016，0.188±0.013，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　8.XBP1-umRNA表達(dá)與性別、年齡

17、、高低分化、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)，均(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.GRP78、ATF6、XBP1-smRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)以及XBP1-umRNA在兩種組織中表達(dá)無差異，結(jié)果提示未折疊蛋白反應(yīng)在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中存在激活情況;未折疊蛋白反應(yīng)中ATF6信號(hào)通路開放參與食管鱗癌的發(fā)生;未折疊蛋白反應(yīng)中IRE1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開放參與食管鱗癌的發(fā)生;未折疊蛋白反應(yīng)與食管鱗癌的發(fā)生存在