ATF6對XBP1基因轉錄調控機制的實驗研究.pdf

1、目的：確定XBP1基因啟動子的轉錄核心區(qū)域及ATF6在內質網應激狀態(tài)(Endoplasmic reticulum stress，ERS)與非應激狀態(tài)時對XBP1啟動子轉錄活性的調控作用。 方法：采用基因重組技術構建ATF6基因和三個結構域缺失體ATF6S1P，ATF6S2P，ATF6SP的真核表達載體pcDNA3.1(-)-ATF6，pcDNA3.1(-)-S1P，pcDNA3.1(-)-S2P，pcDNA3.1(-)-SP；構

2、建XBP1基因啟動子報告載體pGL3-XBP1。針對XBP1啟動子的各個組成元件，分別設計和構建XBP1一系列截短體的報告載體。運用雙熒光素酶報告基因法檢測和確定XBP1啟動子核心啟動子區(qū)，進一步結合免疫印跡方法檢測ATF6及缺失體S2P、S1P、SP在ERS與非ERS狀態(tài)下對XBP1核心啟動子區(qū)轉錄的調控作用。根據XBP1啟動子轉錄活性設計一系列突變體，檢測每個突變型報告載體轉錄活性，在ERS與非ERS狀態(tài)下檢測ATF6及三個缺失體對

3、每個XBP1突變型啟動子的轉錄活性。
　　結果：XBP1啟動子的-407bp～+133bp區(qū)域是轉錄活性調控的核心區(qū)域；XBP1啟動子的-2000bp～-407bp區(qū)域不具有轉錄活性，提示XBP1啟動子的-2000bp～407bp區(qū)域可能含有抑制轉錄活性的組成元件。非ERS狀態(tài)時，ATF6及兩個缺失體S2P、SIP對XBP1啟動子的轉錄活性明顯高于陰性對照，同時免疫印跡結果顯示轉染ATF6及兩個缺失體S2P、S1P后XBP1蛋白表

4、達也明顯升高；而在ERS狀態(tài)時，ATF6及兩個缺失體S2P、S1P對XBP1啟動子的轉錄活性明顯降低，western blot結果顯示轉染ATF6及兩個缺失體S2P、S1P后XBP1蛋白表達也相應減少。突變IRE CS、SP(-1879)結合位點，XBP1轉錄活性明顯增加；在應激與非應激狀態(tài)時，突變IRE CS、SP(-1879)、SP(-690)結合位點，ATF6上調XBP1轉錄活性。
　　結論：ATF6調控XBP1的轉錄在ER