11β-HSD1促脂肪細(xì)胞分化分子機(jī)制研究及11β-HSD1相關(guān)基因P07、S100a16的功能研究.pdf

1、糖尿病及肥胖在西方國家已成為流行，在我國目前也已成為嚴(yán)重影響人們生命健康及生活質(zhì)量最常見的重大疾病，由此引發(fā)的以胰島素抵抗為核心的高血糖、高血壓、高血脂等并發(fā)癥已給社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此進(jìn)一步明確其發(fā)生的分子機(jī)制并篩查新的藥物靶標(biāo)對于控制糖尿病和肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生有著重要意義。 11β-羥化類固醇脫氫酶1(11β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1，11β-HSD1)是一種微粒體酶，廣泛分布于

2、組織中。在人體內(nèi)負(fù)責(zé)氫化可的松與可的松之間(在動物則負(fù)責(zé)皮質(zhì)酮與皮質(zhì)醇之間的轉(zhuǎn)化)的相互轉(zhuǎn)化，使無活性的可的松轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘臍浠傻乃?，從而調(diào)節(jié)局部器官氫化可的松水平，調(diào)節(jié)水電-平衡。糖皮質(zhì)激素作為前受體調(diào)節(jié)劑可促進(jìn)細(xì)胞分化。轉(zhuǎn)基因動物模型研究表明，11β-HSD1在脂肪組織中特異性的過度表達(dá)，可產(chǎn)生類似于代謝綜合征(中心性肥胖、高血壓、胰島素抵抗及高脂血癥)的表型。在11β-HSD1基因敲除鼠肝臟中，糖原合成酶缺損，糖耐量升高，胰島素

3、敏感性升高，血糖下降，其代謝綜合征的癥狀可被逆轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步探討11β-HSD1在糖脂代謝中的作用，本課題從以下幾個方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究：一、11β-HSD1在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠組織中的表達(dá)為進(jìn)一步探討11β-HSD1在肥胖發(fā)生中的作用，我們建立了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型，觀察了11β-HSD1在各組織中的蛋白表達(dá)情況，并檢測了糖脂代謝的有關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明11β-HSD1在肥胖大鼠腦、內(nèi)臟脂肪、骨骼肌中表達(dá)高于正常對照組，在肝臟中表

4、達(dá)低于正常對照組。伴有內(nèi)臟脂肪重量、血脂、血胰島素水平的升高，但不伴有血糖的升高。因此11β-HSD1作為前受體調(diào)節(jié)劑在肥胖鼠內(nèi)臟脂肪組織中高表達(dá)與肥胖相關(guān)，它可能作為肥胖的一個標(biāo)志基因在糖代謝中起重要作用。 二、11β-HSD1在前脂肪細(xì)胞分化中的作用研究采用傳統(tǒng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型，觀察11β-HSD1在前脂肪細(xì)胞分化中的作用，通過油紅染色觀察脂滴形成情況，采用real-timeRT-PCR及Westernb

5、lot方法觀察11β-HSD1在前脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)，并檢測標(biāo)志前脂肪細(xì)胞分化的有關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明11β-HSD1在前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，伴有糖皮質(zhì)激素受體(GR)水平的升高，有促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化作用。 三、11β-HSD1基因沉沒對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響我們以RNA干涉技術(shù)構(gòu)建pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞并通過G418篩選穩(wěn)定表達(dá)

6、株，同時建立pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型，同時觀察脂滴形成，檢測有關(guān)分化標(biāo)志基因，結(jié)果表明11β-HSD1基因沉沒后3T3-L1細(xì)胞分化后期脂滴形成明顯減少，有關(guān)分化標(biāo)志基因發(fā)生改變，11β-HSD1基因沉沒可抑制3T3-L1細(xì)胞的分化。 四、糖皮質(zhì)激素對11β-HSD1作用的藥物模型研究為明確11β-HSD1與糖皮質(zhì)激素的效應(yīng)關(guān)系，我們建立了糖皮質(zhì)激素刺激

7、的濃度與時間梯度模型，采用0-100um不同濃度的氫化可的松刺激3T3-L1細(xì)胞，并采用100um的氫化可的松在0-48小時不同時間點刺激3T3-L1細(xì)胞，采用realtimeRT-PCR檢測糖皮質(zhì)激素受體(GR)及11β-HSD1的RNA的表達(dá)變化，結(jié)果表明11β-HSD1對糖皮質(zhì)激素的刺激是濃度與時間依賴的，但GR對糖皮質(zhì)激素的刺激不存在濃度與時間依賴關(guān)系。有研究表明11β-HSD1通過調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體配基的提供從而調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素

8、作用。11β-HSD1對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用是自動的，可提供適量的糖皮質(zhì)激素供給細(xì)胞分化同時又阻止過多的糖皮質(zhì)激素存在成熟的細(xì)胞中。我們的研究也表明這可能是糖皮質(zhì)激素作用的自動保護(hù)機(jī)制。 五、11β-HSD1相關(guān)基因P07在3T3-L1細(xì)胞分化及肥胖糖尿病小鼠組織中表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究在上述研究基礎(chǔ)上，我們分別建立正常3T3-L1及pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)

9、分化模型，并以分化0天，8天的標(biāo)本進(jìn)行基因芯片篩查，獲得表達(dá)差異明顯的基因P07(Genβank號NM027342)。 1、P07基因在3T3-L1細(xì)胞分化中的表達(dá)P07cDNA全長635bp，開放閱讀框長468bp，編碼155個氨基酸，預(yù)測分子量17.594kDa。應(yīng)用熒光定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)該基因在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程后期表達(dá)升高，在pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的3T3

10、-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中過表達(dá)并伴有PPARγ基因的高表達(dá)；在基因敲除肥胖糖尿病小鼠(ob/ob)脂肪、骨骼肌組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)，因此，我們推測P07是否通過11β-HSD1、PPARγ通路調(diào)節(jié)繼而影響糖脂代謝? 2、P07基因的細(xì)胞組織定位研究PEGFP-C1-P07質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，顯示該蛋白定位在胞漿內(nèi)，且沿質(zhì)膜內(nèi)側(cè)呈區(qū)域性聚集；RT-PCR揭示該基因在小鼠各組織中廣泛表達(dá)，可見于骨骼肌、脂肪、心臟、腦、小腸、大腸

11、和肝臟等組織。免疫組化分析揭示P07蛋白在內(nèi)臟脂肪、大腦、腎、肺臟細(xì)胞胞漿中高表達(dá)，在肝臟、結(jié)腸中表達(dá)弱，在胃、直腸、脾臟、肌肉中不表達(dá)。 鑒于胰島素抵抗并非單一脂肪組織對胰島素敏感性降低的結(jié)果，涉及到機(jī)體多個組織，因此我們推測P07是一種普遍存在的胞漿分子，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 3、P07基因?qū)?xì)胞生長的影響pcDNA-A(-)3.1myc-P07表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染3T3-L1前體脂肪細(xì)胞48小時后，流式細(xì)胞儀分析顯示3T3-

12、L1細(xì)胞可被抑制在S期，不再進(jìn)入G2期。提示P07可能具有HGTD-P家族的共性參與細(xì)胞生長。 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)P07基因含有1個假設(shè)的跨膜區(qū)：一個跨膜區(qū)的氨基酸從104-121。SMART功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，具有一未知功能的結(jié)構(gòu)域：DUF1075，該基因目前已發(fā)現(xiàn)在小鼠、大鼠、人、猩猩和果蠅中，在已知的序列中，其編碼的蛋白質(zhì)高度保守，人與小鼠同源性為92﹪，與果蠅的同源性也高達(dá)47﹪。這提示，P07在生物的發(fā)育和細(xì)胞的分化中

13、可能起著重要的作用。P07作為HGTD-P家族的新成員是否可以誘導(dǎo)低氧狀態(tài)下的細(xì)胞死亡，通過其跨膜結(jié)構(gòu)干擾脂肪代謝、胰島素信號途徑；或者與HGTD-P家族的其他蛋白有相互作用；或者具有新的結(jié)構(gòu)功能域并與其他蛋白質(zhì)相互作用還有待我們進(jìn)一步研究。 六、11β-HSD1相關(guān)基因S100a16在3T3-L1細(xì)胞分化及肥胖糖尿病小鼠組織中表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究以上述同樣方法通過基因芯片篩查，獲得表達(dá)差異明顯的基因S100a16(Genβ

14、ank號NM026416)。 1、S100a16基因在3T3-L1細(xì)胞分化中的表達(dá)S100a16是鈣調(diào)蛋白家族的成員，cDNA全長1091bp，開放閱讀框長374bp，編碼124個氨基酸，預(yù)測分子量14.193kDa。我們應(yīng)用熒光定量RT-PCR驗證S100a16基因在正常3T3-L1細(xì)胞及pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的3T3-L1細(xì)胞分化0-8天的表達(dá)情況，該基因在3T3-L1前脂

15、肪細(xì)胞分化過程中早期表達(dá)不明顯，在分化第8天明顯升高，提示S100a16與3T3-L1細(xì)胞分化有關(guān)。 2、S100a16基因細(xì)胞組織定位研究我們構(gòu)建PEGFP-C1-S100a16的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察S100a16定位，研究顯示該蛋白定位在胞漿內(nèi)，RT-PCR揭示該基因在小鼠各組織中廣泛表達(dá)，可見于骨骼肌、脂肪、心臟、腦、小腸、大腸和肝臟等組織。免疫組化分析提示S100a16蛋白在內(nèi)臟脂肪細(xì)胞膜及胞漿，

16、肝臟、心臟、胃、腎臟、結(jié)腸、肌肉、肺臟細(xì)胞胞漿高表達(dá)，在大腦、脾臟中不表達(dá)。 S100a16是鈣調(diào)蛋白S100家族的成員，S100是低分子量的酸性的鈣連鎖蛋白，含有EF兩個螺旋結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)外作用的調(diào)節(jié)有關(guān)，其家族成員存在A、β等多個同源基因，相關(guān)研究提示其與FGF-1、P40Syn-1對熱休克的釋放，細(xì)胞的生長抑制、細(xì)胞間信號交流、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及軸突的生長、腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。S100a16存在一跨膜結(jié)構(gòu)是否通