結核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450c基因的克隆表達及其生物學功能的初步研究.pdf

1、本課題克隆表達了結核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450c基因，并初步研究了其生物學活性。主要研究工作如下： 一、結核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450c基因的克隆表達及蛋白的純化。根據GenBank中結核分枝桿菌H37Rv基因組核酸序列(登錄號：NC000962)中Rv2389c和Rv2450c基因的cDNA序列，用PrimerPremier5.0軟件設計含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的特異性引物。以結核分枝桿菌H37Rv

2、基因組為模板，利用熱啟動PCR方法分別擴增出兩個目的基因片斷。將兩個片斷分別克隆入克隆載體pSP73，酶切鑒定正確后，再分別克隆入原核表達載體pGEX-4T-2，測序證實序列與GenBank中報告的完全一致后，用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE證實成功表達出了兩個融合蛋白。將誘導表達后的大腸桿菌超聲裂解后，分別取上清、沉淀和菌體做SDS-PAGE電泳，發(fā)現表達的蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在。隨后用GSTrapFF親和層析柱純化

3、可溶性蛋白，用凝血酶水解回收并測定得到蛋白的濃度，Rv2389c蛋白的濃度為306.9μg.ml-1，Rv2450c蛋白的濃度為349.8μg.ml-1，保存于-20℃?zhèn)溆谩?二、Rv2389c和Rv2450c蛋白生物學功能的初步研究。分別培養(yǎng)藤黃微球菌、BCG和結核分枝桿菌H37Rv，制成適當濃度的菌懸液，然后分別加入四種不同濃度(1pM、10pM、100pM、1000pM)的兩種蛋白，置37℃，取不同時間點的菌懸液測定OD6

4、00值，并分別繪制生長曲線。結果顯示，Rv2389c和Rv2450c蛋白對藤黃微球菌、BCG和結核分枝桿菌H37Rv都有促進生長的作用，經上述重組蛋白作用后菌懸液的吸光度值OD600都高于對照組菌懸液約0.6～1.2；兩種蛋白對BCG和結核分枝桿菌H37Rv的促進作用比對藤黃微球菌的作用顯著；在相同濃度下Rv2450c蛋白的促生長作用總體強于Rv2389c蛋白。 綜上所述，本研究成功克隆了結核分枝桿菌Rv2389c和Rv2450