1型鴨肝炎病毒JX株基因組序列分析及VP0、VP1基因的原核表達.pdf

1、隨著水禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，鴨病越來越受到重視，其中鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要傳染病。有關DHV-1的分子生物學相關研究進展緩慢，其基因組結(jié)構(gòu)和蛋白組成只是預測并且還存在差異，對病毒蛋白的功能研究國內(nèi)外還未見報道。本研究通過對DHV-1JX株進行基因組序列的測定與分析，并對其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的VP0和VP1基因進行原核表達和免疫活性檢測，希望為DHV-1的診斷、分子流行病學研究和疫苗的研制提供科學依據(jù)。本研究主要完成了以下研究工作：

2、 (1)根據(jù)GenBank上已發(fā)表的DHV-1基因組序列設計9對互相重疊的特異性引物，以JX株RNA為模板，RT-PCR擴增不同的目的基因，分別克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序，最后拼接出JX株基因組的核苷酸序列，得到7582bp核苷酸序列，并將JX株基因組序列提交到GenBank，登錄號為：EF093502?；蚪M序列包括5’-UTR的部分序列、3’-UTR的部分序

3、列和一個的ORF(長6750bp，編碼一個含有2249個氨基酸的多聚蛋白)?；蚪M結(jié)構(gòu)為：5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR。 (2)運用DNAStar軟件，對JX株基因組序列與GenBank上已發(fā)表的其他不同DHV-1毒株的基因組序列進行同源性比較和遺傳進化分析。結(jié)果表明，JX株與A66株(DQ886445)和C80株(DQ864514)的同源性為99.5％、親緣

4、關系最近，JX株與GenBank上已發(fā)表的其他DHV-1核苷酸序列的相似性都在94％以上，表明JX毒株與世界其他地方不同的DHV-1分離株之間，病毒基因組具有較高的同源性。 (3)根據(jù)DHV-1JX株基因組序列，設計含有BamHI和XhoI酶切位點的VP0基因引物，含有EcoRI和XhoI酶切位點的VP1基因引物，以JX株RNA為模板，RT-PCR擴增VP0和VP1基因。將VP0和VP1基因分別克隆入原核表達載體pET-28a(

5、+)中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28-VP0和pET-28-VP1，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中，用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組融合蛋白VP0和VP1的分子量分別約為32kDa和30kDa?？扇苄苑治龃_認重組VP0和VP1蛋白均主要以不溶性的包涵體形式存在。經(jīng)Western-blot分析證明重組VP0和VP1蛋白均具有良好的免疫學活性。 綜上所述，本研究對DHV-1JX株進