肉毒毒素A型、B型卵黃抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、肉毒毒素(botulinum toxin，BoNT)是一種烈性外毒素蛋白，由厭氧肉毒梭菌（Clostridium botulinum）在生長繁殖過程中所產(chǎn)生，是目前自然界已知毒性最強(qiáng)的生物物質(zhì)。由于毒性極強(qiáng)、制備容易等特點(diǎn)，BoNT被認(rèn)為是最重要的致死性生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，其對(duì)社會(huì)安全與民眾健康的潛在威脅不容忽視。目前，臨床有效治療肉毒中毒的方法是及時(shí)給患者注射多價(jià)馬血清抗毒素，然而在實(shí)際應(yīng)用中受到了很大的限制。因此，發(fā)展新的治療性抗

2、體，具有十分重要的社會(huì)和軍事意義。
　　本研究的主要目的是獲取BoNT重鏈碳端重組蛋白（AHc和BHc）在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)產(chǎn)物，通過分別免疫來航雞制備特異性抗體anti-AHc IgY和anti-BHc IgY，并完成鼠模型的被動(dòng)治療評(píng)價(jià)，為IgY抗體應(yīng)用于肉毒中毒的臨床預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。
　　首先，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建載體表達(dá)獲得目的蛋白AHc和BHc。對(duì)兩組基因序列大腸桿菌密碼子優(yōu)化，分別構(gòu)建含有該目的片

3、段的重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-AHc、pTIG-Trx-BHc，經(jīng)過PCR和酶切鑒定正確后分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中。經(jīng)過測序鑒定，所合成的重組基因AHc和BHc均與預(yù)期結(jié)果一致，其開放閱讀框架全長分別為1332bp、1314 bp。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pTIG-Trx-AHc、pTIG-Trx-BHc PCR雙酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，將構(gòu)建好的表達(dá)菌株BL21(DE3)/pTIG-Trx-AH

4、c、BL21(DE3)/pTIG-Trx-BHc分別在0.3和0.2 mol/L IPTG、16℃條件下表達(dá)。在此條件下，兩種重組蛋白均可以獲得可溶性表達(dá)占菌體裂解液上清的20％，超聲碎菌后的上清溶液分別經(jīng)過Ni-NTA親和純化后，獲得純度可以達(dá)到95％以上的目的蛋白AHc和BHc。在Western Blot鑒定實(shí)驗(yàn)中，AHc和BHc蛋白可分別與抗天然BoNT/A、BoNT/B馬血清抗毒素發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。
　　然后，通過四

5、次連續(xù)免疫健康母雞獲得高效價(jià)的特異性IgY抗體。純化后的AHc蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合，乳化充分后，按照200μg/只的劑量經(jīng)分別肌肉多點(diǎn)注射。在首次免疫后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，共四次，加強(qiáng)免疫使用等體積的非完全弗氏佐劑與兩種目的蛋白混合乳化，免疫劑量和方法與首次相同。首次免疫前一天以及每次免疫后一周采集雞蛋和血清樣本，編號(hào)后放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ庖哌^程中收集到的樣品均采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測抗體效價(jià);第四次免疫后一周收集

6、到的雞蛋樣品通過水稀釋和硫酸銨鹽析法從雞蛋中提取純化特異性anti-AHc IgY抗體。采用相同的方法制備和純化anti-BHc IgY抗體。分別四次免疫健康母雞后，在AHc和BHc實(shí)驗(yàn)組收集到的血清和雞蛋樣品中均檢測到特異性的抗體。免疫后血清中檢測到的抗體效價(jià)可達(dá)到1∶106，而卵黃抗體效價(jià)約1∶105，并且抗體效價(jià)可以穩(wěn)定保持一個(gè)月不下降。
　　最后，測定了純化獲得的anti-AHc IgY和anti-BHc IgY抗體的效價(jià)

7、，并在小鼠模型中對(duì)中和效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在厭氧條件下培養(yǎng)A型、B型肉毒梭菌，收集的產(chǎn)毒培養(yǎng)基純化處理，最終分離得到具有生物活性的BoNT/A和BoNT/B毒素。在BALB/c小鼠模型中測定兩種天然毒素的半數(shù)致死劑量，其中BoNT/A攻毒方式為腹腔注射、BoNT/B為腹腔注射和灌胃注射。
　　為了測定評(píng)價(jià)anti-AHc IgY抗體的中和活性，3個(gè)濃度的IgY(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)溶液分別與3個(gè)濃度的

8、BoNT/A(100× LD50、200× LD50、400× LD50)在明膠-磷酸鹽緩沖液體系中等體積預(yù)先混合，在37℃恒溫水浴箱中孵育30-45 min，取0.2 ml樣品混合物小鼠腹腔注射檢測。對(duì)注射后的小鼠進(jìn)行96 h觀察，每隔6h觀察一次，記錄小鼠生存狀態(tài)和死亡情況，生存曲線用Prism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制。之后，利用相同的動(dòng)物方法測定anti-BHc IgY抗體的中和活性。4× LD50/i.p.BoNT/B溶液分別與等體積倍

9、比稀釋的系列anti-BHc IgY抗體混合腹腔注射檢測，4× LD50/i.g.BoNT/B溶液分別與等體積倍比稀釋的系列anti-BHc IgY抗體混合灌胃注射檢測。在天然BoNT/A攻毒試驗(yàn)，anti-AHc IgY可以在體外預(yù)混合后可以有效的中和毒素的活性。其中，40 ng的anti-AHcIgY可以抵抗最高劑量為20× LD50天然BoNT/A毒素的攻擊，保護(hù)率均為100％。在anti-BHc IgY攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的

10、anti-BHc IgY對(duì)天然毒素BoNT/B的中和能力有所不同。實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射毒素-抗體混合物后，中毒癥狀相比對(duì)照組明顯減輕并且生存率也隨著anti-BHc IgY抗體含量劑量的增加而增加。
　　在抗體-毒素體外預(yù)混的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，anti-BHc IgY給藥途徑和BoNT/B攻毒途徑不同分別通過不同的途徑注射模擬研究IgY抗體在毒素預(yù)防和治療中的作用。首先，通過小鼠實(shí)驗(yàn)測定腹腔攻毒時(shí)抗體灌胃給藥時(shí)時(shí)間與小鼠生存情況之間的關(guān)系。

11、4× LD50/i.g.劑量灌胃攻毒時(shí)，過量IgY抗體（10 mg/kg）在不同的時(shí)間點(diǎn)通過腹腔途徑給藥。然后，在測定IgY注射時(shí)間同小鼠生存情況關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定不同劑量的IgY抗體對(duì)BoNT/B毒素中和能力的影響。之后，采用相同的方法分析灌胃攻毒，測定IgY抗體腹腔給藥時(shí)間和劑量與最終小鼠生存情況之間的關(guān)系。通過分析測定灌胃攻毒時(shí)抗體腹腔給藥時(shí)時(shí)間、劑量與小鼠生存情況之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)anti-BHc IgY腹腔注射時(shí)間和劑

12、量影響抗體對(duì)4× LD50/i.g.BoNT/B的中和能力。在攻毒后1.5h注射anti-BHc抗體后，實(shí)驗(yàn)組小鼠中毒癥狀相比對(duì)照組明顯減輕。在劑量實(shí)驗(yàn)中，注射GPB緩沖液的對(duì)照組和低劑量anti-BHc IgY實(shí)驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)出了經(jīng)典的肉毒中毒癥狀，均在36h以內(nèi)死亡。10和20μg/kg IgY劑量組小鼠的存活時(shí)間延長，但不能完全保護(hù)小鼠免受4× LD50/i.p.劑量的毒素攻擊;隨著anti-BHc IgY劑量升高到40和80μg/

13、kg，在4× LD50/i.p的毒素攻擊下兩組小鼠均全部存活。此外，通過灌胃途徑檢測anti-BHc IgY對(duì)天然毒素BoNT/B的中和能力實(shí)驗(yàn)也獲得了類似的結(jié)果。隨著IgY的劑量的增加（從0.2mg/kg到0.4mg/kg），小鼠的存活率也隨之升高;當(dāng)IgY為0.8和1.6 mg/kg時(shí)可以完全中和BoNT/B的毒素活性。
　　本研究實(shí)現(xiàn)了AHc、BHc兩種重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，且保留了良好的抗原性;重組蛋白能夠

14、有效刺激健康母雞發(fā)生免疫反應(yīng)，穩(wěn)定、大量制備高效價(jià)IgY，血清中檢測到的抗體效價(jià)可達(dá)到1∶106，而卵黃抗體效價(jià)約1∶105;在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)除較好的中和活性，40 ng的anti-AHc IgY可以抵抗最高劑量為20×LD50天然BoNT/A的攻擊，40μg anti-BHc IgY在4× LD50/i.p的BoNT/B毒素攻擊下兩組小鼠均全部存活。此外，anti-BHc IgY不僅可以在體外混合中有效中和毒素的活性，還可以在小鼠