耳聾基因診斷的臨床實(shí)踐.pdf

1、全國(guó)性聾病分子流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，盡管遺傳性耳聾具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，但大多數(shù)非綜合征性遺傳性耳聾僅由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變所致，從而奠定了在中國(guó)開(kāi)展耳聾基因診斷的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也催生出新的耳聾整體預(yù)防思路和方法。本課題致力于通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的耳聾基因診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷模式，使耳聾基因組研究所取得的偉大成果能夠被廣泛應(yīng)用于中國(guó)臨床遺傳性耳聾病因?qū)W診斷和聾兒出生缺陷防控的實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)其“基礎(chǔ)→臨床”的順利轉(zhuǎn)化，從而推動(dòng)國(guó)內(nèi)臨床

2、耳聾基因診斷、遺傳咨詢和基于耳聾基因診斷的產(chǎn)前診斷工作的廣泛開(kāi)展，最終實(shí)現(xiàn)總體降低耳聾發(fā)生及出生缺陷的目標(biāo)。 第一部分：耳聾基因診斷及遺傳咨詢的臨床應(yīng)用 一、聾病分子診斷實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化建設(shè)臨床遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室是聾病分子診斷的基地，其臨床的主體功能是向需求者提供包括實(shí)驗(yàn)室診斷和提供遺傳咨詢的臨床遺傳服務(wù)。由于國(guó)內(nèi)尚無(wú)專門針對(duì)臨床分子遺傳學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行資格認(rèn)證的機(jī)構(gòu)和法規(guī)，因此，借鑒國(guó)外的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和辦法，結(jié)合國(guó)情，按照國(guó)內(nèi)現(xiàn)行

3、的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的法律法規(guī)，發(fā)展自己的聾病分子診斷實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化建設(shè)方案，不失為一個(gè)行之有效的方法，并將為該領(lǐng)域在我國(guó)健康發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 本研究依據(jù)解放軍聾病分子診斷中心成立后的大量臨床實(shí)踐，結(jié)合國(guó)內(nèi)相應(yīng)的法規(guī)，在實(shí)驗(yàn)室的硬件建設(shè)(場(chǎng)地和設(shè)備)、軟件建設(shè)(人員配備，檢測(cè)內(nèi)容)，以及質(zhì)量管理等方面提出規(guī)范化建設(shè)的思路，以期為國(guó)內(nèi)聾病分子診斷實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)起到拋磚引玉的作用。 二、臨床非綜合征性耳聾的基

4、因診斷 自2002年初，解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心開(kāi)始常見(jiàn)耳聾基因診斷的臨床實(shí)踐，截至2008年4月20日，已有3202人接受了耳聾基因診斷。本節(jié)對(duì)這一實(shí)踐進(jìn)行全面、系統(tǒng)地總結(jié)和討論，以推動(dòng)臨床耳聾基因診斷的規(guī)范化實(shí)踐，使其得到更為廣泛和深入的臨床應(yīng)用。其中，著重論述臨床耳聾基因診斷的規(guī)范化流程，以及檢測(cè)內(nèi)容、策略和方法，分析GJB2、SLC26A4、線粒體DNA1494/1555突變?cè)诓煌軝z者群體中的陽(yáng)性檢出率情況，分析G

5、JB2基因和大前庭水管綜合征相關(guān)SLC26A4基因的基因型和表型以及它們之間的關(guān)系，繪制GJB2相關(guān)耳聾和EVAS的聽(tīng)力曲線模型，并討論在臨床耳聾基因診斷過(guò)程中需要注意的一些具體問(wèn)題。 三、非綜合征性耳聾的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷 遺傳咨詢是遺傳學(xué)服務(wù)中極為重要的過(guò)程和內(nèi)容，與耳聾基因診斷是不可分割的整體。而基于耳聾基因診斷的產(chǎn)前診斷可以從根本上預(yù)防和阻斷遺傳耳聾，成為實(shí)現(xiàn)“預(yù)防耳聾出生缺陷”目標(biāo)的重要步驟和手段。本研究通過(guò)對(duì)

6、3000余人的耳聾相關(guān)遺傳咨詢實(shí)踐，以及為34個(gè)家庭實(shí)施的共37次產(chǎn)前診斷實(shí)踐，建立了針對(duì)非綜合征性感音神經(jīng)性耳聾的基于耳聾基因診斷的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷的規(guī)范化流程和內(nèi)容，討論了知情同意在遺傳咨詢中的重要作用。 四、臨床耳聾基因診斷信息管理系統(tǒng)(LIMS)的構(gòu)建 為順應(yīng)醫(yī)學(xué)信息化、網(wǎng)絡(luò)化的時(shí)代要求，我們同北京瑞林薩爾科技有限公司合作，根據(jù)耳聾基因診斷臨床實(shí)踐的具體要求，在Linux+Apache+PHP+PostgreS

7、QL的系統(tǒng)平臺(tái)上，采用B/S分布式數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)，研發(fā)了國(guó)內(nèi)的首套《耳科患者信息管理系統(tǒng)》。在使用過(guò)程中，該系統(tǒng)表現(xiàn)出功能豐富、安全穩(wěn)定、操作直觀快捷、可擴(kuò)展性強(qiáng)、維護(hù)方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)室信息的高效、準(zhǔn)確的數(shù)字化、網(wǎng)絡(luò)化管理的目標(biāo)，并為實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)升級(jí)，構(gòu)建多中心會(huì)診模式的數(shù)據(jù)交換，以及與HIS系統(tǒng)和檢測(cè)設(shè)備接口進(jìn)行無(wú)縫連接打下了良好的基礎(chǔ)和框架。此套軟件系統(tǒng)，以及在研發(fā)過(guò)程中臨床醫(yī)生與軟件設(shè)計(jì)公司建立的良好合作模式將為進(jìn)一

8、步發(fā)展更加先進(jìn)和完善的實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)化信息管理系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 第二部分：基因芯片技術(shù)在耳聾基因診斷中的應(yīng)用 一、基因芯片技術(shù)的臨床應(yīng)用可行性研究 本課題組與博奧生物有限公司合作，在大規(guī)模全國(guó)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，針對(duì)國(guó)人非綜合征性耳聾的突變熱點(diǎn)，將等位基因特異性引物延伸PCR與通用芯片相結(jié)合，合作開(kāi)發(fā)出一款遺傳性耳聾基因診斷芯片。為評(píng)估其在臨床應(yīng)用的可行性，我們應(yīng)用耳聾基因芯片對(duì)158名非綜合征性感

9、音神經(jīng)性耳聾患者進(jìn)行分子病因?qū)W研究。前者可以同時(shí)檢測(cè)四個(gè)國(guó)人中常見(jiàn)的耳聾相關(guān)基因中的9個(gè)熱點(diǎn)突變，包括GJB2(35delG，176del16bp，235delC及299300delAT)，GJB3(538C＞T及547G＞A)，SLC26A4(IVS7-2A＞G、2168A＞G)和線粒體DNA12S rRNA(A1555G)。 同時(shí)，應(yīng)用酶切方法或直接測(cè)序的方法分別對(duì)以上基因編碼區(qū)序列進(jìn)行平行檢測(cè)，以驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。

10、結(jié)果顯示，除兩例純合235delC被判讀為雜合外，基因芯片的結(jié)果同酶切及測(cè)序方法結(jié)果一致，后者的陽(yáng)性患者檢出率為70例(44.3％)，與芯片檢測(cè)結(jié)果相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.250)。本研究顯示，針對(duì)國(guó)人常見(jiàn)耳聾相關(guān)基因熱點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)的耳聾基因芯片對(duì)非綜合征性重度和極重度耳聾患者的突變檢出率高(42.41％)。與傳統(tǒng)方法相比，它具有快速、高通量、高準(zhǔn)確性、低成本等特點(diǎn)，能夠滿足臨床對(duì)基因檢測(cè)的要求；且其操作簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化，適于推廣，因而

11、顯示出廣闊的臨床應(yīng)用前景。 二、基因芯片技術(shù)在非綜合征性耳聾臨床快速基因診斷中的應(yīng)用 為進(jìn)一步提高檢出率和降低成本，我們?nèi)コ嗽行酒系腉JB2167delT和SLC26A4707T＞C位點(diǎn)，增加了線粒體DNA1494C＞T突變位點(diǎn)，評(píng)估調(diào)整后的基因芯片在臨床快速耳聾基因診斷中的作用。 結(jié)果顯示，基因芯片能夠檢出76％的大前庭水管綜合征患者，與測(cè)序方法(95％)存在差距。研究提示，測(cè)序仍是大前庭水管綜合征基因診

12、斷必不可少的檢測(cè)方法，基因芯片應(yīng)與測(cè)序相結(jié)合，共同構(gòu)建臨床耳聾基因診斷平臺(tái)，后者能更好地將基因芯片的快速、經(jīng)濟(jì)、高通量的優(yōu)勢(shì)與測(cè)序的高準(zhǔn)確性和高檢出率的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合；另外，在討論部分，我們根據(jù)遺傳學(xué)規(guī)律對(duì)不同的芯片檢測(cè)結(jié)果做出了規(guī)范化的臨床遺傳學(xué)解釋；在芯片檢測(cè)位點(diǎn)的增加、芯片系統(tǒng)的微型化以及芯片標(biāo)記技術(shù)三個(gè)方面對(duì)耳聾基因診斷芯片的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)進(jìn)行了展望。最后，對(duì)耳聾基因組學(xué)與納米芯片技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建防聾體系所產(chǎn)生的巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行

13、了評(píng)估。 第三部分：耳聾基因診斷的推廣普及 為使耳聾基因診斷理論和技術(shù)能及早為更多的醫(yī)務(wù)工作者、聽(tīng)障患者及其家屬了解和使用，我們通過(guò)加強(qiáng)門診和病房的宣傳、聾校宣教、開(kāi)辦全國(guó)耳聾基因診斷學(xué)習(xí)班、創(chuàng)建國(guó)內(nèi)首個(gè)耳聾基因診斷博客和首個(gè)耳聾基因診斷網(wǎng)站、與民間聾人論壇建立合作關(guān)系，以及利用新聞媒體、發(fā)表論文、參加學(xué)術(shù)會(huì)議等各種方式和方法，對(duì)不同層面的對(duì)象如醫(yī)務(wù)工作者、聽(tīng)障患者和計(jì)生委等婦幼保健者以及與診聾、防聾事業(yè)相關(guān)人士進(jìn)行全方