抗桔霉素單克隆抗體制備及其在紅曲桔霉素檢測中的應用.pdf

1、紅曲，泛指紅曲菌(Monascusspp.)在米飯或淀粉基質上生長發(fā)酵的產品。紅曲在我國的應用至今已有一千多年的歷史，是我國傳統(tǒng)的特色發(fā)酵食品，主要生產地在福建、浙江、臺灣等省，被廣泛應用于食品發(fā)酵劑、食用色素、食品防腐劑、食品增香劑及中藥的生產。然而自1995年，法國Blanc教授證實紅曲中桔霉素的存在，使紅曲的安全性受到質疑。目前桔霉素的檢測方法主要是儀器檢測方法，存在檢測成本高、時間長和難于推廣等缺點，因此，迫切需要建立一種經濟、

2、簡便和快速的檢測方法。 本文采用活性酯法將桔霉素與載體蛋白連接，獲得了桔霉素的完全抗原，通過雜交瘤細胞技術，制備了抗桔霉素的單克隆抗體，建立了間接競爭ELISA，并分析了紅曲中桔霉素含量。具體內容如下。 1、桔霉素人工抗原的構建 桔霉素(citrinin，CIT)分子量為250.3，屬于只有反應原性而無免疫原性的半抗原(hapten)，必須與蛋白質等載體結合構建成完全抗原才能刺激動物產生抗體。根據(jù)桔霉素具備活潑羧

3、基基團的結構特點，采用活性酯法分別與牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)和卵清蛋白(ovalbumin，OVA)偶聯(lián)制備得到免疫抗原CIT-BSA和包被抗原CIT-OVA，偶聯(lián)比分別為8.4:1和6.3:1。并采用紫外和紅外光譜法對偶聯(lián)產物進行了分析。 2、抗桔霉素單克隆抗體的制備及其ELISA的建立 以CIT-BSA免疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，融合率約為61.

4、3％。采用有限稀釋法，從陽性雜交瘤細胞株中篩選得到兩株能穩(wěn)定分泌高特異性、高靈敏度的抗CIT單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為5H1和787。 以上述制備的抗原和抗體為材料，通過對包被條件、抗原抗體反應條件等研究，優(yōu)化得到了CIT的間接競爭ELISA條件為：CIT-OVA用0.05mol/mLpH9.6的碳酸鹽緩沖液在4℃包被12h，包被濃度為2μg/mL，5H1和787所產腹水抗體用緩沖液(含0.05％(v/v)Tween-

5、20的0.01mol/LpH7.4的磷酸緩沖溶液生理鹽水，PBST)分別稀釋為1:2000和1:1000，競爭抗原與抗體混勻37℃加入酶標板中反應1h，然后加入酶標二抗(以PBST作1:4000稀釋)37℃反應1h，加底物37℃反應10min，用2mol/LH2SO4終止反應，測定OD492m值。 根據(jù)上述優(yōu)化的ELISA條件，采用間接競爭ELISA，以競爭抗原CIT的濃度對數(shù)為橫坐標，競爭抑制率為縱坐標，作圖得到CIT對5H1

6、和7B7抗體的競爭抑制曲線，CIT的檢測靈敏度分別為24.95ng/mL和33.78ng/mL，線性方程分別y=-7.14x+72.97，(R2=0.962)，y=-7.83x+77.56，(R2=0.982)，線性范圍均為2ng/mL～200ng/mL。 同時，在上述優(yōu)化條件下，研究了5H1和787分泌的抗體對黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2、M1)和棒曲霉素(patulin)的特異性，結果表明，本研究所獲得5H1及787分

7、泌的抗體與以上毒素均無交叉反應。說明獲得的兩株細胞分泌抗體的特異性好。 3、紅曲中的桔霉素加標回收及ELISA檢測 在經HPLC確證不含CIT的空白紅曲樣品中，分別添加不同濃度CIT，添加量在0.05μg/g～0.5μg/g時，經間接競爭ELISA分析，CIT的平均添加回收率為83.2％～94.4％，變異系數(shù)為6.3％～9.6％。在此基礎上，選取來源不同的28株紅曲菌制得紅曲米，經ELISA檢測，樣品中桔霉素含量在0.0