巴弗洛霉素A1對胃癌SGC-7901細胞的抑制作用及增強其對5-氟尿嘧啶敏感性的研究.pdf

1、目的：
　　驗證5-氟尿嘧啶（5-FU）可誘導胃癌SGC-7901細胞產(chǎn)生保護性自噬，觀察自噬抑制劑巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1）對胃癌SGC-7901細胞自噬水平的影響，初步探討改變自噬水平對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力和對5-FU敏感性的影響。
　　方法：
　　1、分別以含0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0ug/mL5-FU的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清）培養(yǎng)胃

2、癌SGC-7901細胞24、48h，應用MTT法檢測5-FU對胃癌SGC-7901細胞細胞增殖能力的影響。
　　2、以含1.25ug/mL5-FU的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞0、3、6、12、24、48h，應用 MTT法檢測胃癌 SGC-7901細胞細胞增殖能力的變化，應用蛋白質(zhì)印記法（Western Blot）檢測5-FU對胃癌SGC-7901細胞自噬及凋亡蛋白表達的影響。
　　3、將細胞分為

3、4個組：對照組（以不含干預藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡稱 Cnotrol組；Bafilomycin A1組（以含100nMBafilomycin A1的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡稱BAF組；5-氟尿嘧啶組（以含1.25ug/mL5-FU的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡稱5-FU組和5-氟尿嘧啶+Bafilomycin A1組（以含有100nMBafilomycin A1和1.25ug/mL5-F

4、U的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）以下簡稱5+B組。應用掃描電鏡、免疫組化及Western Blot法檢測細胞自噬水平變化，應用MTT法檢測細胞增殖能力，Transwell法檢測細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western Blot檢測凋亡相關蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、5-FU對胃癌SGC-7901細胞的細胞增殖能力抑制具有時間（0-48h）、濃度（0-10ug/mL）依賴性，當5-FU濃度為1.

5、25 ug/mL，作用時間為24h時胃癌細胞增殖能力顯著低于對照組（RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h）（P=0.000），5-FU作用時間為48h時胃癌細胞增殖能力顯著低于對照組（RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h）（P=0.000）。
　　2、當5-FU濃度為1.25 ug/mL，作用時間為48h，隨著作用時間的延長自噬相關蛋白Beclin1相對表達量（0-24h）逐漸增高，到達24h出現(xiàn)高峰后逐漸降低；LC3Ⅱ/Ⅰ相

6、對表達量（0-48h）逐漸增多；P62相對表達量（0-12h）逐漸增高，12h到達高峰后逐漸降低；凋亡相關蛋白Bax表達量（0-6h）逐漸升高，6h到達高峰后逐漸降低,Bcl-2相對表達量（0-48h）逐漸增高，Bcl-2/Bax比值12h開始高于對照組。
　　3、當100nMBafilomycin A1聯(lián)合1.25ug/mL5-FU作用于胃癌SGC-7901細胞24h，掃描電鏡見5+B組與5-FU組相比自噬體大量堆積，自噬溶酶體

7、顯著減少；免疫組化見 Beclin1平均光密度5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；Western Blot見自噬相關蛋白LC3Ⅱ∕Ⅰ相對表達量5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；P62相對表達量5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；MTT法見細胞增殖能力5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.004）；遷移實驗見遷移細胞5+B組少于5-FU組，差別具

8、有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；侵襲實驗見侵襲細胞數(shù)5+B組（51.00±5.83個/視野）少于5-FU組（103.33±4.53個/視野），差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）；凋亡率5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；Western Blot見促凋亡蛋白Bax相對表達量5+B組高于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；抗凋亡蛋白 Bcl-2相對表達量5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學意義（P

9、=0.000），Bcl-2/Bax比值5+B組低于5-FU組，差別具有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。
　　4、當100nMBafilomycin A1作用于胃癌SGC-7901細胞24h，掃描電鏡見BAF組與 Control組相比自噬體堆積，自噬溶酶體減少；免疫組化見 Beclin1平均光密度BAF組顯著低于Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.008）；Western Blot見自噬相關蛋白LC3Ⅱ∕Ⅰ相對表達量BAF組

10、高于Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；P62相對表達量 BAF組高于 Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；MTT法見細胞增殖能力BAF組低于Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；遷移實驗見遷移細胞數(shù) BAF組少于 Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；侵襲實驗見侵襲細胞數(shù) BAF組少于 Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；凋亡率BAF組高于

11、Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；Western Blot見促凋亡蛋白Bax相對表達量BAF組高于Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.005）；抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量BAF組低于Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.046），Bcl-2/Bax比值BAF組低于Control組，差別具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。
　　結(jié)論：
　　1、5-FU可誘導胃癌SGC-7901細胞產(chǎn)生