HCMV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、背景和目的:動(dòng)脈粥樣硬化(AS)嚴(yán)重威脅人類健康,雖然大量的流行病學(xué)資料顯示傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因子是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素,但動(dòng)脈粥樣硬化仍然有著許多潛在的病因亟待探索.低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)是在AS病變部位SMC上表達(dá)的唯一脂蛋白受體,LRP結(jié)構(gòu)或功能的紊亂可能是引發(fā)AS形成和發(fā)展的一個(gè)重要因素,LRP作為AS疾病的一個(gè)危險(xiǎn)因子,其致病的主要原因可能是促發(fā)泡沫細(xì)胞的形成,HCMV感染后SMC的LRP表達(dá)及脂質(zhì)代謝方面的變化及其

2、機(jī)理是該課題重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容.如果調(diào)節(jié)和控制病毒對(duì)宿主細(xì)胞的作用是病毒性疾病治療和預(yù)防的一個(gè)重要方面.綜上所述,我們?cè)O(shè)想:1、HCMV與ECs:①HCMV感染ECs可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變,引起通透性改變和內(nèi)皮完整性的變化;②感染后的細(xì)胞功能可能發(fā)生改變,進(jìn)一步導(dǎo)致血小板及單核細(xì)胞在內(nèi)皮的粘附;③感染性病毒顆粒的釋放可能成為侵襲SMC的病毒來(lái)源.2、HCMV與SMC:①HCMV感染SMC可能導(dǎo)致感染細(xì)胞的增殖;②HCMV所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用可能會(huì)導(dǎo)

3、致SMC表面LRP活性的異常表達(dá),進(jìn)而引起宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝的改變;③HCMV病毒感染可能對(duì)SMC粘附分子表達(dá)產(chǎn)生影響;④外源性更昔洛韋、HCMV的ASON對(duì)IE基因和L基因,SMC的LRP表達(dá)、TG和TC的代謝產(chǎn)生影響.基于以上設(shè)想,擬主要觀測(cè):①感染細(xì)胞形態(tài)、脂質(zhì)代謝變化,主要包括IE基因、L基因變化、粘附分子改變.②感染細(xì)胞表面LRP變化及細(xì)胞脂質(zhì)代謝、病毒核酸代謝、病毒抗原表達(dá);③更昔洛韋、HCMV的ASON作用后平滑肌細(xì)胞IE基

4、因及LRP表達(dá)等方面的變化;④從分子水平調(diào)查CHD患者HCMV的感染狀況.探討以上內(nèi)容的變化特點(diǎn)和規(guī)律,在細(xì)胞和分子水平上闡述HCMV致血管壁細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng),為HCMV致AS發(fā)病機(jī)理的研究及其治療和預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ).方法和技術(shù)路線:1.采用HCMV AD169株感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,建立HCMV的細(xì)胞感染模型.2.對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的感染模型,主要運(yùn)用熒光顯微鏡觀測(cè)病毒抗原的表達(dá),熒光定量PCR方法動(dòng)態(tài)觀測(cè)病毒D

5、NA代謝變化,ELISA和細(xì)胞ELISA方法檢測(cè)感染細(xì)胞粘附分子(sICAM-1、VCAM-1)的變化,流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)測(cè)定HEC感染后的凋亡狀況,化學(xué)法測(cè)定ECs感染后的ATP酶活性的改變.3.對(duì)于平滑肌細(xì)胞體外感染模型,實(shí)驗(yàn)分四組(對(duì)照組;感染組;更昔洛韋作用組;反義寡核苷酸作用組),主要應(yīng)用RT-PCR方法和細(xì)胞ELISA觀測(cè)不同因素作用后LRP-mRNA和蛋白的表達(dá),微量化學(xué)分析法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的改變,應(yīng)用PCR方法檢測(cè)HCMV的

6、IE基因、L基因的變化規(guī)律,常規(guī)法觀測(cè)SMC增殖指數(shù)的變化.4.為驗(yàn)證HCMV感染對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng),運(yùn)用ELISA和捕捉ELISA法、放射免疫分析技術(shù)、定量PCR技術(shù)檢測(cè)了經(jīng)冠脈造影確診的119例CHD患者血清HCMV-IgM、IgG抗體、HCMV-DNA、血清ET、TNF和hs-CRP的水平.5.各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,兩組均值間比較用t檢驗(yàn),各組間率的比較采用X<'2>檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在計(jì)算機(jī)上用origan