逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)E1A激活基因阻遏子過表達(dá)抑制頸動(dòng)脈球囊損傷大鼠新生內(nèi)膜形成.pdf

1、本研究為進(jìn)一步觀察E1A激活基因阻遏子(CREG)對(duì)VSMCs分化的影響及其在血管損傷后RS發(fā)生中的作用，以在體頸動(dòng)脈大鼠球囊損傷模型為研究對(duì)象，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)CREG基因在損傷血管中大量表達(dá)并觀察CREG表達(dá)對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控及對(duì)損傷血管內(nèi)膜增生的影響，以期深入探討CREG基因在經(jīng)皮冠脈內(nèi)介入治療術(shù)(PCI)術(shù)后再狹窄發(fā)生中的作用。 研究方法：建立大鼠頸動(dòng)脈球囊拉傷模型，應(yīng)用pluronic膠F127涂布逆轉(zhuǎn)錄

2、病毒pLNCX-CREG和pLNCX-GFP于損傷動(dòng)脈外膜，分別于球囊損傷和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染后2天、4天、7天、14天和28天切取受損動(dòng)脈段。蘇木精-曙紅染色觀察冰凍切片中血管形態(tài)學(xué)改變。精確測(cè)量每段血管內(nèi)膜層和中間層面積，計(jì)算內(nèi)膜層/中間層比率以判定內(nèi)膜增生情況。免疫組化或Westernblot分析CREG，SMα-actin，desmin和ki-67的表達(dá)，TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡。 研究結(jié)果：應(yīng)用大鼠血管損傷模型觀察CRE

3、G對(duì)血管損傷后內(nèi)膜增生的作用顯示，與未損傷組比較，單純血管損傷后的第2天、第4天CREG表達(dá)量分別顯著降低約35％和37％，至損傷后第7天基本恢復(fù)損傷前水平；同時(shí)，血管內(nèi)膜中細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白ki-67在損傷后第2天開始表達(dá)，于第4～7天達(dá)到高峰，在第14天顯著降低。與ki-67相反，平滑肌分化標(biāo)志蛋白SMα-actin和desmin在損傷后第2～14天表達(dá)減少，14天后逐漸恢復(fù)正常。TUNEL分析顯示，受損血管中血管平滑肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的

4、時(shí)相與細(xì)胞增殖時(shí)相基本一致。在損傷血管外膜涂布含有pLNCX-CREG或pLNCX-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒的PluronicF127后，熒光顯微鏡觀察到感染后第2～28天中膜及外膜層均有GFP蛋白大量表達(dá)。與之對(duì)應(yīng)，CREG感染組大鼠球囊損傷后2～4天，血管損傷局部的CREG蛋白表達(dá)較GFP組比較明顯增加。同時(shí)，血管切片分析顯示：損傷后7、14、28天，CREG感染組內(nèi)膜增生面積較GFP損傷組分別下降32％，59％和60％，內(nèi)膜/中膜比率分別

5、顯著降低了45％，38％和36％。GFP感染組和單純損傷組比較上述指標(biāo)均無(wú)顯著性差別。與GFP感染組相比，血管損傷后第7、14、28天，CREG感染組血管外膜層面積也明顯減少。進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血管損傷后第2～4天，CREG感染組血管SMCski-67表達(dá)降低，SMα-actin和desmin表達(dá)顯著增加；同時(shí)，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象被明顯抑制。ERKMAPK活性分析顯示，與GFP組比較，損傷后第2、4、7、14