MicroRNA-2010對CD4+T細胞活化的調(diào)控及其在尋常型銀屑病發(fā)病中的作用.pdf

1、目的:尋常型銀屑病是一種常見的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病，以鱗屑性紅斑為特征，因影響外觀，給患者造成嚴重的心理負擔。尋常型銀屑病的病因及發(fā)病機制尚不明確，目前研究認為T細胞介導的免疫反應，特別是Th1細胞介導的自身免疫反應及調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制功能缺陷，在尋常型銀屑病發(fā)病中起重要作用。越來越多的研究表明microRNAs通過調(diào)控相應靶基因的表達在CD4+T細胞的異常活化中起著十分重要的作用。我們課題組之前利用AffymetrixmicroR

2、NA基因芯片技術(shù)比較了9例尋常型銀屑病患者及9例健康對照外周血單個核細胞(PBMCs)中microRNAs表達水平的差異并通過RT-PCR進行驗證，發(fā)現(xiàn)microRNA-210(miR-210)在尋常型銀屑病患者PBMCs中表達明顯升高。本課題進一步探索了miR-210在尋常型銀屑病免疫失調(diào)中的作用及機制，為揭示該病的發(fā)病機制提供新的思路。
　　方法:收集18例尋常型銀屑病病人及18例正常對照的健康人外周血，利用密度梯度離心法分離

3、PBMCs，免疫磁珠法分離CD4+T細胞。利用實時熒光定量PCR(realtime PCR)檢測miR-210表達水平;利用Mirbase/Targetscans/PicTar等生物信息學軟件在線預測miR-210的潛在靶基因;選擇可能與尋常型銀屑病發(fā)病相關(guān)的靶基因，進而利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證兩者之間的調(diào)控關(guān)系;利用realtimePCR檢測CD4+T細胞中miR-210潛在靶基因mRNA的表達水平，同時利用Western blo

4、t檢測其蛋白水平;利用T淋巴細胞轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-210 mimic或inhibitor及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染正常人及尋常型銀屑病病人CD4+T細胞;利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子水平。
　　結(jié)果:與正常對照相比，miR-210在尋常型銀屑病人CD4+T細胞中表達水平明顯升高;Mirbase/Targetscans/PicTar等生物信息學軟件預測顯示轉(zhuǎn)錄因子FOXP3是miR-210的潛在靶基因之一，

5、熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實FOXP3為miR-210的靶基因;在尋常型銀屑病人CD4+T細胞中FOXP3表達水平明顯降低，與miR-210的表達水平呈顯著負相關(guān)。在正常人CD4+T細胞中過表達miR-210時，與對照組相比，F(xiàn)OXP3蛋白表達水平明顯下降，同時細胞因子IL-10、TGF-β表達水平亦明顯降低，而IFN-γ表達水平明顯升高;相反，在尋常型銀屑病外周血CD4+T細胞中的特異性抑制miR-210表達時，F(xiàn)OXP3蛋白表達水平明顯