黏著斑激酶對肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控作用的研究.pdf

1、肝纖維化(hepaticfibrosis)是多種致病因子引起慢性肝病，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的一個動態(tài)過程與共同病理途徑。肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、增殖，進(jìn)而合成大量的膠原等細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)成分被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。 HSC增殖受多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，粘著斑激酶(FAK)處于整合素、生長因子等信號通路的交匯點(diǎn)?；A(chǔ)研究表明，F(xiàn)AK磷酸化后，對多種類型細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要影響，如促進(jìn)增殖，正性調(diào)控細(xì)胞周期，增強(qiáng)黏

2、附、遷移，誘導(dǎo)凋亡等。其第397酪氨酸位點(diǎn)(Tyr397)是自主磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)磷酸化后，可以順次激活其余磷酸化位點(diǎn)，放大FAK催化活性。因此，可以說，Tyr397是FAK發(fā)揮生物學(xué)功能的扳機(jī)點(diǎn)。 黏著斑激酶相關(guān)非激酶(FRNK)位于FAKC-末端，缺乏激酶區(qū)，包含黏著斑定位區(qū)(FAT)，可與FAK競爭粘著斑(FAP)上的結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)向調(diào)控FAK的作用。 細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1

3、)為細(xì)胞周期的始動因子，與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK4/6)結(jié)合并激活后者，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生G1/S期轉(zhuǎn)換。 張曉嵐等應(yīng)用膽總管結(jié)扎(BDL)大鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化發(fā)展，HSC大量活化增殖，F(xiàn)AK表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且FAK與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)明顯正相關(guān)，提示FAK有促HSC增殖作用。但迄今為止，F(xiàn)AK促HSC增殖機(jī)制國內(nèi)外均未見報(bào)道。為此，以CyclinD1與CDK4為切入點(diǎn)，有機(jī)結(jié)合整體和離體試驗(yàn)，從細(xì)

4、胞周期角度探討FAK促HSC增殖的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下兩部分： 第一部分：p-FAK(Tyr397)、CyclinD1與CDK4在膽汁淤積性大鼠肝纖維化形成過程中的動態(tài)表達(dá) 目的：探討膽汁淤積性大鼠肝纖維化形成過程中，p-FAK(Tyr397)、CyclinD1及CDK4含量的變化及其與HSC增殖的關(guān)系。 方法：采用BDL膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，將50只雄性SpragueDawley大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組

5、、1wk模型組、2wk模型組、3wk模型組與4wk模型組，共5組，每組10只。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物，假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE染色、Masson三色染色確定模型建立情況；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測定α-SMA表達(dá)；Westernblot及RT-PCR方法研究p-FAK(Tyr397)、CyclinD1與CDK4及其mRNA在肝纖維化不同時間肝組織中含量的動態(tài)變化。 結(jié)論：肝纖維化形成

6、過程中，HSC大量活化增殖，p-FAK(Tyr397)蛋白、CyclinD1與CDK4蛋白及其mRNA表達(dá)明顯增加；α-SMA、p-FAK(Tyr397)與CyclinD1、CDK4之間呈顯著正相關(guān)。FAK磷酸化促HSC增殖及肝纖維化形成機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期蛋白有關(guān)。 第二部分：黏著斑激酶相關(guān)非激酶對FN刺激的肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 目的：探討應(yīng)用FRNK表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC，選擇性抑制FAK磷酸化，對FN誘導(dǎo)的HSC

7、細(xì)胞周期時相、CyclinD1與CDK4的影響，從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)FAK促HSC增殖的分子機(jī)制。 方法：應(yīng)用含2％胎牛血清、100IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素、4mmol·L-1谷氨酰胺及1mol·L-1HEPES的RMPI1640培養(yǎng)液，37℃、5％CO2條件下體外培養(yǎng)HSC。以FN刺激HSC增殖，根據(jù)Lipofectamine(R)Reagent提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)

8、染。采用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞周期時相表達(dá)；Westernblot技術(shù)檢測FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、CyclinD1與CDK4蛋白的表達(dá)情況；RT-PCR共擴(kuò)增技術(shù)檢測CyclinD1、CDK4及內(nèi)參照β-actinmRNA表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)分5組：①對照組；②FN組；③脂質(zhì)體組；④空質(zhì)粒組；⑤FRNK質(zhì)粒組。②～⑤組中FN濃度均為50μg·mL-1。 結(jié)論：體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明