三角帆蚌貝殼基質(zhì)蛋白基因silkmapin的生物礦化功能研究.pdf

1、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）是我國特有的淡水育珠蚌，近幾年來淡水珍珠產(chǎn)量的95％都是來自于三角帆蚌。在三角帆蚌的貝殼和珍珠的研究中，鑒定和分析基質(zhì)蛋白的組成和功能對理解其珍珠質(zhì)的形成機理具有非常重要的意義。以前所研究的貝殼基質(zhì)蛋白大都是從海水貝類中分離鑒定的，有關淡水貝類貝殼基質(zhì)蛋白的研究還比較少。本研究從三角帆蚌外套膜中分離鑒定得到了一個新的貝殼基質(zhì)蛋白基因silkmapin，并對其結構和功能進行了研究。
　

2、　1.對三角帆蚌silkmapin基因進行了克隆、序列分析、結構預測、組織表達分析及原位雜交檢測。運用RACE技術得到該基因cDNA序列的全長為1242bp，擁有一個978bp的開放閱讀框。該基因編碼一個30.89KD的蛋白質(zhì)，主要含有甘氨酸（Gly），占整個分量的34.41%，序列中所含的天冬氨酸（Asp）主要集中在C末端，推測silkmapin的C末端具有結合Ca2+的能力。二級結構推測結果表明silkmapin主要為β折疊，高級結

3、構為一細絲狀蛋白質(zhì)。實時定量PCR結果表明silkmapin只在外套膜的邊緣外褶和緣膜部的上皮細胞表達。進一步進行原位雜交檢測，結果與實時定量PCR的結果一致，在外套膜邊緣和緣膜部的上皮細胞中檢測到了強烈的信號，實時定量PCR和原位雜交的結果可以說明silkmapin參與了三角帆蚌貝殼珍珠層和棱柱層的形成。
　　2.通過貝殼修復實驗研究silkmapin在貝殼生物礦化中的作用。將三角帆蚌進行活體破殼處理，破殼的一邊作為實驗組，同時

4、設有兩個對照組，對外套膜組織和修復殼樣品進行收集，修復出的新殼用以進行掃描電子顯微鏡（SEM）觀察，外套膜組織樣品用以熒光定量表達分析。掃描電鏡觀察結果顯示三角帆蚌貝殼生長過程是由外而內(nèi)逐層生長，生長順序依次為角質(zhì)層—棱柱層—珍珠層。薄薄的角質(zhì)層最先完成生長，之后棱柱層文石晶體顆粒在角質(zhì)層表面生長，棱柱層晶體生長是在橫向和縱向兩個方向上同時進行。棱柱層達到成熟后，片狀的正六邊形文石珍珠層晶體在其上開始堆積，從棱柱層生長轉向珍珠層時候無明

5、顯的過渡期。還發(fā)現(xiàn)棱柱層生長符合“擠壓假說”的特點，而珍珠層則是典型的“磚墻型”結構。結合掃描電鏡觀察和在不同時期外套膜中表達的結果，發(fā)現(xiàn)在棱柱層和珍珠層生長的時期，silkmapin在破殼實驗組中的表達量遠遠高于對照組，說明silkmapin的確參與了三角帆蚌貝殼棱柱層和珍珠層的礦化過程。
　　3.通過插片實驗進一步研究silkmapin在三角帆蚌珍珠形成過程中的作用。選取了健康規(guī)格相同的三角帆蚌進行無核珍珠插核手術，定期進行珍

6、珠囊組織樣品采集和珍珠小顆粒的收集，珍珠囊組織樣品用以進行熒光定量組織表達分析；珍珠小顆粒經(jīng)過處理后放在掃描電子顯微鏡（SEM）下進行表面形貌的觀察。掃描電鏡觀察的結果表明三角帆蚌珍珠的礦化生長過程分為碳酸鈣無序沉積和有序沉積兩個階段。這兩個階段珍珠顆粒的表面形貌變化也很明顯，從一開始的凹凸不平、雜亂堆積到后來的平整光滑、有序堆疊。結合電鏡觀察和在不同時期珍珠囊中表達的結果，發(fā)現(xiàn)silkmapin在珍珠成核期的表達量呈現(xiàn)一個逐步上升的趨