三角帆蚌貝殼珍珠層顏色形成相關基因的克隆與表達分析.pdf

1、三角帆蚌是我國特有的優(yōu)良淡水育珠蚌。顏色是評價珍珠質量的重要指標。供片貝貝殼珍珠層顏色(貝殼內殼色)顯著影響珍珠顏色。本研究從珍珠或貝殼珍珠層呈色的直接因素（金屬離子、有機物和珍珠層結構）著手，以實驗室構建的紫色家系三角帆蚌（貝殼珍珠層顏色為紫色）和白色家系三角帆蚌（貝殼珍珠層顏色為白色）為實驗材料，從紫色家系和白色家系三角帆蚌外套膜和珍珠囊比較轉錄組文庫中篩選得到4個三角帆蚌貝殼珍珠層顏色形成相關基因。
　　1．三角帆蚌HcGI

2、FLP基因的克隆與表達分析
　　克隆得到三角帆蚌兩個胃內因子樣蛋白（gastric intrinsic factor-like protein，GIFLP）基因（HcGIFLP1和HcGIFLP2），并進行熒光定量、原位雜交及原核表達實驗。HcGIFLP1基因cDNA全長619bp，編碼140個氨基酸；HcGIFLP2基因cDNA全長821bp，編碼148個氨基酸，GenBank登錄號分別為KR822703和KR822704。Hc

3、GIFLP1和HcGIFLP2基因編碼的多肽N端均含有一段由23個氨基酸組成的信號肽，無跨膜結構域，核苷酸序列和氨基酸序列相似度均較高。熒光定量結果顯示，HcGIFLP1基因主要在肝胰腺中表達，并且在紫色蚌中的表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01）。HcGIFLP2基因主要在外套膜中表達，在紫色蚌后端緣膜中的表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01）。原位雜交結果顯示，HcGIFLP1和HcGIFLP2基因在外套膜中的表達部位基本相同，雜交

4、信號主要出現(xiàn)在外套膜緣膜的外上皮細胞，邊緣膜中褶的外上皮細胞中也有一些信號。原核表達結果顯示，兩個基因的重組蛋白均主要以包涵體的形式存在。根據(jù)兩個基因的氨基酸序列設計多肽制備多克隆抗體，并用原核表達純化蛋白檢測抗體的特異性，結果顯示HcGIFLP1蛋白的抗體特異性較好，只能檢測到自身的重組蛋白，HcGIFLP2蛋白的抗體未能檢測到自身及HcGIFLP1的重組蛋白。
　　2．三角帆蚌HcCUBDC基因的克隆與表達分析
　　克隆

5、得到三角帆蚌一個CUB結構域包含蛋白（CUB domain containing protein，CUBDC）基因HcCUBDC，并進行熒光定量和原位雜交檢測分析。HcCUBDC基因cDNA全長5158 bp，編碼639個氨基酸，GenBank登錄號為KP067952。HcCUBDC蛋白含有4個CUB結構域，屬于CUB超家族，N端含有一段由19個氨基酸組成的信號肽，無跨膜結構域。熒光定量結果顯示，HcCUBDC基因在各個組織中均有表達，

6、其中肝胰腺中表達量最低。在紫色蚌中，后端緣膜表達量極顯著高于前端緣膜（P<0.01）；在白色蚌中，前端和后端緣膜之間表達差異不顯著。HcCUBDC基因在紫色蚌后端緣膜中表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端緣膜中表達差異不顯著。外套膜原位雜交結果顯示，HcCUBDC基因主要在外套膜緣膜外上皮細胞中表達。
　　3．三角帆蚌HcCA2基因的克隆與表達分析
　　克隆得到了三角帆蚌一個碳酸酐酶（carbonic

7、anhydrase，CA）基因HcCA2基因，并進行熒光定量和原位雜交檢測分析。HcCA2基因cDNA全長1770bp，編碼332個氨基酸，GenBank登錄號為KR822705。HcCA2蛋白含有1個CA結構域，屬于α-CA超家族，N端含有一段由18個氨基酸組成的信號肽，無跨膜結構域。熒光定量PCR結果顯示，HcCA2基因主要在外套膜中表達，在其他組織中表達量很低。在紫色蚌中，后端緣膜表達量極顯著高于前端緣膜（P<0.01）；在白色蚌

8、中，前端和后端緣膜之間表達差異不顯著。HcCA2基因在紫色蚌后端緣膜中的表達量極顯著高于白色蚌（P<0.01），在紫色和白色蚌前端緣膜中的表達差異不顯著。在珍珠形成過程中，插片后的前19天該基因表達量很低，19天之后表達量顯著升高并維持在同一水平。貝殼修復過程中，該基因在對照組中表達不穩(wěn)定，在前7個時間點處理組中的表達量均極顯著低于對照組（P<0.01），在后7個時間點處理組幾乎不表達。原位雜交結果顯示，HcCA2基因在外套膜內外上表皮