定位于人類(lèi)17號(hào)染色體上新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA-ncRNA基因的鑒定及其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作用研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文定位于人類(lèi)17號(hào)染色體上新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA-ncRNA基因的鑒定及其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作用研究姓名：于萌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：于秉治20090401人1 7 號(hào)染色體上的長(zhǎng)的非編碼R N A ，并在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中具有癌基因的特性。實(shí)驗(yàn)方法一、 臨床資料收集的神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤樣本來(lái)自日本多個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)，經(jīng)手術(shù)或是送檢而得。2 3 6 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤樣本用于比較基因組雜交技術(shù)分析，1 3 6 例樣本

2、用于基因表達(dá)譜的分析，其中各有1 1 2 例和7 0 例散發(fā)病例。臨床標(biāo)本根據(jù)國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期系統(tǒng)( I N S S ) 進(jìn)行分類(lèi)。7 0 例散發(fā)病例中臨床I 期1 5 例，I I 期8 例，I I I 期1 7例，Ⅳ期2 5 例，I V s 期5 例，該樣本的表達(dá)分析用于K a p l a n ．M e i e r 生存曲線分析。本病例中相對(duì)應(yīng)的M Y C N 擴(kuò)增情況已在發(fā)表文章中報(bào)道。二、 方法1 、比較基因組雜交技術(shù)( a

3、r r a y ．C G H ) 和表達(dá)譜基因芯片技術(shù)利用包涵整個(gè)人類(lèi)基因組的2 4 6 4 個(gè)細(xì)菌人工染色體( B A C ) 克隆的生物芯片，對(duì)2 3 6 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行比較基因組雜交技術(shù)分析，分辨率小于1 ．2 M b 。從臨床分期不同的神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織提取R N A ，通過(guò)o l i g o - c a p p i n g 法建立c D N A 文庫(kù)獲得5 3 4 0 個(gè)e D N A ，對(duì)1 3 6 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行基因

4、表達(dá)譜分析，該芯片僅限于日本千葉癌中心研究局的相關(guān)神經(jīng)母細(xì)胞瘤研究。比較基因組雜交( a r r a y - C G H )和表達(dá)譜基因芯片的相關(guān)數(shù)據(jù)可以登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心( N C B I ) 高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)( h t t p ：／／w w w ．n c b i ．n l m ．n i h ．g o v ／g e o ／) 進(jìn)行查詢(xún)。相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)分別為G S E 5 7 8 4 和G S E 5 7 7 9 。2 、

5、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含1 0 ％滅活胎牛血清及抗生素的D M E M 培養(yǎng)基或是R P M l l 6 4 0 培養(yǎng)基對(duì)N I H 3 T 3 和C O S 7 以及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為3 7 “ C ，C 0 2 分壓為5 ％的細(xì)胞培養(yǎng)箱。根據(jù)廠家說(shuō)明，用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n ) 進(jìn)行C O S 7 和N I H 3 T 3 細(xì)胞