人胚胎永久造血干細胞生物學特性及其與AGM區(qū)、胎肝造血微環(huán)境關系的實驗研究.pdf

1、胚胎期造血系統(tǒng)的發(fā)育可分為兩個階段：原始造血階段和永久造血階段。在胚胎首先出現(xiàn)的造血為原始造血(primitivehematopoiesis)，位于胚外卵黃囊中央血島，僅產(chǎn)生原始有核紅細胞和巨核細胞，無法產(chǎn)生脾集落形成單位和長期重建造血的造血干細胞(long-termrepopulatinghematopoieticstemcells，LTR-HSCs)；能產(chǎn)生LTR-HSC、為胚胎大部分時期的發(fā)育提供造血物質(zhì)、為生后造血系統(tǒng)提供HSC

2、s儲備池的永久造血稍后發(fā)生。原始造血發(fā)生于卵黃囊血島已被普遍認可，但永久造血的起源部位尚存爭議。長期以來認為永久造血也是起源于胚外卵黃囊，而近10年來越來越多的證據(jù)表明永久造血起源于胚內(nèi)的主動脈旁胚臟壁(paraaorticsplanchnopleura，PAS)/主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephrosregion，AGMregion)。AGM區(qū)正成為國際上造血發(fā)生發(fā)育機制、造血分化機制研究中的熱點。

3、 由于永久HSC在AGM區(qū)存留時間短、數(shù)目極為有限，加之胚體幼小、取材困難，有關研究還十分有限。MarcosMA等報道小鼠AGM區(qū)細胞表達c-kit，AA4.1，Mac-1和Sca-1，但未對這類細胞的造血活性進一步研究。DelassusS等分離孕11天小鼠的AGM單個細胞，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)CD34+ckit+細胞具有多系造血形成能力；RT-PCR和基因分析發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)CD34+ckit+細胞表達紅系(β-globin)和髓系(MPO)標

4、志，不表達淋巴系標志CD3、Thy-1和λ5，多數(shù)細胞還表達干細胞相關基因標記如AML-1、PU.1、GATA2和Lmo2以及造血生長因子受體G-CSF-R。人AGM區(qū)HSCs的表型迄今未有定論，也缺乏其基因表達的研究。 永久造血的發(fā)育受到兩方面因素的調(diào)控，即造血微環(huán)境及遺傳基因。AGM區(qū)細胞和脂肪細胞。 1.胎肝基質(zhì)細胞和胎肝MSC表面標記的檢測 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞或造血細胞抗原CD31、CD34、

5、CD45在二者表面為陰性表達，而CD29、CD44、CD105、CD106、CD166均為陽性表達；與GVHD發(fā)生相關的標記HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40、CD40L均為陰性。間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示人FL基質(zhì)細胞和MSC表達細胞外基質(zhì)蛋白Fibronectin、α-SMA，同時表達發(fā)育中的FL細胞即上皮細胞的標記AFP和E-cadherin。 2.造血相關基因和造血生長因子mRNA的表達

6、 FL基質(zhì)細胞的RT-PCR檢測結(jié)果顯示人FL基質(zhì)細胞表達造血相關基因GATA-2mRNA，表達gp130、BMP-4、TGF-β1mRNA，表達IL-3、IL-6、SCF、FLT-3L、OSM、EPO等造血生長因子mRNA，不表達TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。FL-MSC除不表達造血因子IL-3mRNA外，其他表達情況與基質(zhì)細胞表達情況相同。 3.ELISA檢測胎肝基質(zhì)細胞和胎肝MSC培養(yǎng)上清中造血因子水平

7、 FL基質(zhì)細胞和MSC均分泌造血生長因子BMP4、TGF-β1、EPO和IL-6，且因子水平高于胎齡35天YS來源基質(zhì)細胞和軀干成纖維細胞(P＜0.05)。二者P5代細胞分泌因子的水平基本無顯著差異，而在P0、P10、P15代以基質(zhì)細胞分泌水平較高，其中各代FL基質(zhì)細胞EPO分泌水平始終高于FL-MSC。 4.小結(jié)本研究分離培養(yǎng)FL造血期FL基質(zhì)細胞和MSC。結(jié)果顯示，人FL基質(zhì)細胞和MSC表達造血微環(huán)境細胞外基質(zhì)蛋白Fib

8、ronectin、α-SMA，同時表達發(fā)育中的胎肝細胞即上皮細胞的標記AFP和E-cadherin，提示二者對胎肝造血期造血和肝臟發(fā)育具有重要意義。RT-PCR和ELISA檢測到胎肝基質(zhì)細胞表達多種造血生長因子，有作用于中胚層調(diào)節(jié)造血細胞形成的BMP4和TGF-β1，有作用于早期HSC和造血祖細胞的HGFs(IL-3、IL-6、SCF、FLT-3L)，尚有作用于紅系的EPO表達。與FL-MSC相比，同一組織來源的胎肝基質(zhì)細胞表達更多的造