鹿茸間充質(zhì)細胞全長cDNA文庫的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本試驗以梅花鹿二杠茸為研究材料，通過組織學(xué)解剖，取得鹿茸的間充質(zhì)，經(jīng)過胰酶消化，培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)細胞，成功構(gòu)建了鹿茸間充質(zhì)細胞的cDNA文庫。用TRIZOL提取鹿茸間充質(zhì)細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，長距離PCR方法合成雙鏈cDNA；PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K水解、純化后，用SfiI酶切；將酶切產(chǎn)物進行分級分離，回收500bp以上的cDNA組分，并與λTrip1Ex2載體連接；連接產(chǎn)物經(jīng)體外蛋白包裝，產(chǎn)生初級文庫；鑒定文庫的滴度后，進行文

2、庫擴增。隨機挑取若干個噬菌斑，進行PCR擴增，檢測所構(gòu)建的cDNA文庫的質(zhì)量。經(jīng)測定該文庫初始滴度為3.0×105pfu/ml，擴增后滴度為6.0×108pfu/ml。插入片段長度為大于500bp，也有1000bp以上的片斷。反轉(zhuǎn)錄過程中采用附加序列的方法使全長mRNA得到反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA是完整的，完全符合cDNA文庫的要求。 鹿茸間充質(zhì)細胞全長cDNA文庫的成功構(gòu)建，為我們釣取鹿茸間充質(zhì)特異基因研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，同時

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