成肌細(xì)胞中T1R1-R1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸篩選及分子機(jī)制.pdf

1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。mTOR能夠組成兩種功能復(fù)合物:mTORC1和mTORC2，其中mTORC1能夠通過(guò)其上游多種“感受器”感受細(xì)胞內(nèi)外的一系列信號(hào)變化，包括能量狀態(tài)、生長(zhǎng)因子和激素、營(yíng)養(yǎng)因子等，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和降解，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)因子中，氨基酸既是蛋白質(zhì)合成的必需底物，也是mTORC1活性調(diào)節(jié)的必要的信號(hào)分子。在氨基酸中，亮氨

2、酸、谷氨酰胺、精氨酸被認(rèn)為能有效調(diào)節(jié)mTORC1活性。且氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)感受體參與氨基酸依賴性的mTOR活性調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　近幾年研究發(fā)現(xiàn)一種G蛋白偶聯(lián)受體T1R1/T1R3(Taste Receptor Type1subtype1/3，T1R1/T1R3)能夠作為廣譜性的氨基酸感受體感應(yīng)胞外氨基酸，通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+增加激活ERK1/2來(lái)參與調(diào)控mTOR。然而目前研究主要針對(duì)胞外總的氨基酸，究竟哪些氨基酸參與該過(guò)程并不清楚，因此T1

3、R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)是否具有氨基酸特異性及其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。
　　本課題研究?jī)?nèi)容由兩部分組成，本實(shí)驗(yàn)以C2C12小鼠成肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，第一部分在確定T1R1/T1R3對(duì)mTOR信號(hào)具有調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，篩選由T1R1/T1R3介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸。第二部分進(jìn)一步探索T1R1/T1R3參與氨基酸依賴性的mTOR活性調(diào)節(jié)的機(jī)制及其特異性。
　　第一部分主要結(jié)果如下:
　　1、Q-PC

4、R方法測(cè)定2％馬血清誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞分化0、2、4、8天，T1R1/T1R3的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)T1R1/T1R3在小鼠C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中有表達(dá)。
　　2、C2C12成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3能介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號(hào)。在有氨基酸存在的情況下，利用信號(hào)通路抑制劑及激動(dòng)劑處理細(xì)胞，Western blot方法測(cè)定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的變化，鑒定T1R1/T1R3對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用，并篩選出最佳抑

5、制劑濃度。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+螯合劑BAPTA-AM及ERK1/2活性抑制劑U0126都能極顯著抑制氨基酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P＜0.01)，且具有濃度依賴性效應(yīng)。T1R1對(duì)氨基酸的特異性增強(qiáng)劑IMP預(yù)處理細(xì)胞則能顯著增加氨基酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P＜0.05)。并且BAPTA-AM濃度為10μmol/L，U0126濃度為15μmol/L，即能達(dá)到極顯著抑制效果。說(shuō)明C2C12成肌細(xì)胞內(nèi)T1R1/T1R3也能介導(dǎo)氨基酸通過(guò)促進(jìn)胞

6、內(nèi)Ca2+升高及激活ERK1/2來(lái)參與調(diào)控mTOR信號(hào)。
　　3、蛋氨酸參與T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控蛋白質(zhì)合成。不同氨基酸處理細(xì)胞后，Western blot方法測(cè)定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的變化、SUnSET非放射性方法檢測(cè)蛋白質(zhì)合成速率、Q-PCR檢測(cè)蛋白質(zhì)降解標(biāo)志基因，篩選出參與T1R1/T1R3介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)七種能引起胞內(nèi)Ca2+增加的氨基酸(50mmol/L)中只有蛋氨酸能極顯

7、著激活mTORC1(P＜0.01)，蛋氨酸能極顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)合成速率，該過(guò)程依賴于mTOR，并且能極顯著抑制蛋白質(zhì)降解途徑關(guān)鍵基因Atrogin-1、MuRF-1的mRNA表達(dá)水平(P＜0.01)。說(shuō)明參與T1R1/T1R3介導(dǎo)的調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸主要為蛋氨酸，表明蛋氨酸可能成為研究氨基酸受體T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的主要氨基酸。
　　第二部分主要結(jié)果如下:
　　1、蛋氨酸能被T1R1/T1R3介導(dǎo)通

8、過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+增加激活ERK1/2，從而調(diào)控mTOR活性。在有蛋氨酸誘導(dǎo)的情況下，利用信號(hào)通路抑制劑及激動(dòng)劑處理，F(xiàn)luo-8檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+變化，Western blot方法測(cè)定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的變化、SUnSET非放射性方法檢測(cè)蛋白質(zhì)合成速率，驗(yàn)證C2C12成肌細(xì)胞中蛋氨酸調(diào)控mTOR信號(hào)的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Met能促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+增加，Ca2+螯合劑BAPTA-AM、PLC特異性抑制劑U73122、ERK1

9、/2活性抑制劑U0126都能極顯著抑制蛋氨酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P＜0.01)，T1R1/T1R3對(duì)氨基酸的特異性增強(qiáng)劑IMP則能顯著增加蛋氨酸誘導(dǎo)的mTORC1的激活(P＜0.05)。說(shuō)明蛋氨酸能激活mTORC1，且蛋氨酸調(diào)控mTOR依賴于T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　2、ERK1/2在T1R1/T1R3介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR中具有一定作用。Western blot檢測(cè)通路關(guān)鍵蛋白p

10、-ERK1/2的水平，驗(yàn)證ERK1/2活性對(duì)蛋氨酸調(diào)控mTOR的重要性。研究發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM處理能極顯著增加蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平(P＜0.01)，且具有濃度依賴性效應(yīng)，與p-S6K1變化水平相反。IMP處理則能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平，U0126處理抑制ERK1/2活性則能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平。
　　3、T1R1/T1R3介導(dǎo)氨基酸調(diào)控mTOR信號(hào)具有氨基酸特異性。利用不同類型氨基酸處理

11、細(xì)胞，Western blot檢測(cè)通路關(guān)鍵蛋白水平的變化，探索T1R1/T1R3介導(dǎo)氨基酸激活mTORC1的氨基酸特異性。研究發(fā)現(xiàn)蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸五種氨基酸處理細(xì)胞，隨著氨基酸濃度增加，蛋氨酸及亮氨酸能誘導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的水平逐漸增加，而谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸誘導(dǎo)則無(wú)顯著變化。亮氨酸激活mTORC1也依賴于胞內(nèi)Ca2+及ERK1/2。證實(shí)T1R1/T1R3調(diào)控mTOR信號(hào)的主要是蛋氨酸，其他氨基酸效果不顯著。