大黃素對非酒精性脂肪肝肝臟單純肝脂肪變性改善作用及機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
   非酒精性脂肪肝(NonalcoholicFattyLiverDisease,NAFLD)作為一種慢性肝臟損害性疾病在很多國家普遍存在。非酒精性脂肪肝的整體發(fā)生率在西方國家達(dá)到15%-40%,在亞洲發(fā)生率為9%-40%,并且在過去的十五年迅速地增長。本病包括了一系列的疾病過程,從單純性脂肪肝,非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)到肝纖維化,肝硬化,最終進(jìn)展為肝細(xì)胞癌

2、。非酒精性脂肪肝的存在與心包脂肪增加,頸動(dòng)脈狹窄,心血管死亡率增加有關(guān),這就使本病的預(yù)后更加嚴(yán)重。該病已成為嚴(yán)重影響我國人民身心健康和國民經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展和穩(wěn)定的主要疾病之一。
   NAFLD病機(jī)不甚明了,大多數(shù)學(xué)者較為認(rèn)可的有“二次打擊”學(xué)說,“初次打擊”主要為胰島素抵抗,各種病因所致NAFLD幾乎普遍存在胰島素抵抗現(xiàn)象。胰島素抵抗通過促使外周脂解增加和高胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪儲(chǔ)積,并誘致對內(nèi)外性損害因子敏感性增高;二次打擊

3、主要為反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物增多,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化及其異常細(xì)胞因子的作用,進(jìn)而引起壞死、甚至進(jìn)展性肝纖維化。
   最近研究顯示,脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用,其中脂聯(lián)素成為研究熱點(diǎn),而存在于肝臟細(xì)胞中的脂聯(lián)素受體2被認(rèn)為NAFLD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。脂聯(lián)素與其結(jié)合后通過調(diào)控與肝臟脂質(zhì)氧化相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子PPAR-alpha及其控制的脂質(zhì)氧化限速酶來增加肝臟細(xì)胞脂質(zhì)氧化,從而減少肝臟脂質(zhì)沉積。目前世界范圍內(nèi)尚無療效確

4、切,安全穩(wěn)定的治療NAFLD的藥物,研發(fā)通過化學(xué)合成或從中草藥中尋找干預(yù)脂聯(lián)素受體2-PPAR-alpha信號途徑,增加肝臟脂質(zhì)氧化,達(dá)到治療目的藥物成為熱點(diǎn)。
   非酒精性脂肪肝屬中醫(yī)“肥胖”“脅痛”“黃疽”等病范疇。多由過食肥甘厚味,濕熱蘊(yùn)藉中焦,濕熱阻滯,氣機(jī)受阻,氣血運(yùn)行不暢,而疲血內(nèi)生。病理關(guān)鍵在“濕(痰)”“熱”,“瘀”。大黃素為中藥何首烏、大黃的主要活性成分之一,何首烏能補(bǔ)益肝腎,又能潤腸通便而泄?jié)?,大黃下瘀熱祛

5、濁瘀,于本病病機(jī)和主治最是合拍,自古為中醫(yī)家治療“肥胖”“脅痛”“黃疽”等病的要藥,而大黃素在降脂、保護(hù)肝細(xì)胞等方面有一定效果,作用于NAFLD關(guān)鍵病理因素。本實(shí)驗(yàn)旨在用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段系統(tǒng)觀察其療效,并深入探討其可能的作用靶點(diǎn),為從中草藥中開發(fā)治療NAFLD藥物作探索性研究。
   目的:
   1.觀察大黃素對非酒精性脂肪肝早期體內(nèi)及體外模型的影響,包括對體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝細(xì)胞脂肪變、肝功能、血脂代謝的影響,肝細(xì)胞

6、株內(nèi)TG、肝酶等影響。
   2.研究大黃素治療非酒精性脂肪肝的可能作用機(jī)制,包括改善脂質(zhì)沉積、保護(hù)肝細(xì)胞、減輕氧化應(yīng)激以及對脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1的蛋白及基因表達(dá)的影響
   方法:
   C57BL6小鼠62只,正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為分為2組,空白組對照(A,13只)和模型組(M,49只),組間大鼠體重差異無顯著性(P>0.05)??瞻讓φ战M給以普通飼料,其余各組均給以高脂飼

7、料。正常組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料,模型組給予高脂飼料(88%標(biāo)準(zhǔn)飼料+10%豬油+2%膽固醇)喂養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食,動(dòng)物房保持安靜,自然采光,溫度25℃左右,喂養(yǎng)持續(xù)8周,分別從正常對照組和空白模型組隨機(jī)挑選一只,取肝臟做病理切片,證實(shí)非酒精性脂肪肝形成。再將模型組完全隨機(jī)法分為4組:模型組、大黃素組、人參皂苷組、羅格列酮組。8周后,空白對照組灌胃給以DMSO,(5%DMSO20mg/kg體重)、人參皂苷組灌胃給以人參皂苷(20mg/kg)、大黃

8、素組灌胃給以大黃素(20mg/kg),羅格列酮組給予羅格列酮灌胃(10mg/kg)。
   治療4周,取小鼠血清及肝臟組織標(biāo)本。測體質(zhì)量,稱肝質(zhì)量,計(jì)算肝指數(shù),根據(jù)試劑盒說明測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酷(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C),游離脂肪酸(FFA);對肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查,HE染色觀察其脂肪變程度;蛋白免疫印跡法(westeoblotting)檢測脂聯(lián)素受體2、

9、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量(real-timePCR)檢測脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1基因表達(dá)。
   HepG2細(xì)胞,用1640培養(yǎng)基+10%FBS培養(yǎng)(37℃,5%CO2)。分組:設(shè)空白組、造模組、大黃素組、人參皂苷組、羅格列酮組。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔,加入誘導(dǎo)液(油酸:棕櫚酸2∶1)誘導(dǎo)24h,分別加入大黃素、人參皂苷、羅格列酮,觀察

10、24h、48h、72h。油紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,測定TG、肝酶含量,蛋白免疫印跡法(westeoblotting)檢測脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha.CPT1、ACOX1蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量(real-timePCR)檢測脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1基因表達(dá)。
   所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或者方差分析(ANOVA),當(dāng)P<0.05時(shí),認(rèn)為處理組和對照組之

11、間有顯著性差異。
   結(jié)果:
   第一部分,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
   1.根據(jù)肝臟病理狀態(tài),可見彌漫性肝細(xì)胞大泡樣脂肪變,無明顯炎癥、壞死及纖維化,NAFLD小鼠早期單純性肝脂肪變性階段模型復(fù)制成功。
   2.與模型組相比,大黃素可降低小鼠體質(zhì)量,但無明顯差異(P>0.05)。降低肝臟質(zhì)量,肝指數(shù)(P<0.05,P>0.05).肝臟病理顯示,大黃素可明顯改善肝臟脂肪沉積(P<0.01)。肝細(xì)胞形態(tài)、排列均明顯

12、好轉(zhuǎn)。大黃素可明顯降低血清ALT、AST(P<0.05),明顯降低血清TG,F(xiàn)FA,CHO水平(P<0.05),降低血清LDL,升高HDL(P>0.05)。大黃素可降低MDA水平(P>0.05),明顯升高SOD水平(P<0.01)。
   3.大黃素能上調(diào)脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1的蛋白及基因表達(dá)(P<0.01)。
   第二部分,大黃素治療非酒精性脂肪肝體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
   1.誘導(dǎo)液誘

13、導(dǎo)HepG2細(xì)胞株24h后,油紅染色顯示細(xì)胞內(nèi)有大小不等的脂滴存在,且細(xì)胞活力及形態(tài)較好,表明NAFLD單純肝脂肪變性體外模型形成。
   2.大黃素可以改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積、降低TG含量(P<0.05),降低ALT及AST含量,升高SOD含量(P<0.01)。
   3.大黃素能上調(diào)HepG2細(xì)胞株造模后脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1的蛋白及基因表達(dá)(P<0.01)。
   結(jié)論:

14、>   通過上述大黃素對NAFLD體內(nèi)、體外藥效及其可能的作用機(jī)制初步研究得出一下結(jié)論:
   1.大黃素能減輕NAFLD大鼠體質(zhì)量,減輕肝臟腫大及肝臟濕質(zhì)量,改善肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。顯示大黃素有一定的減肥作用,通過減輕內(nèi)臟脂肪堆積達(dá)到治療NAFLD。
   2.大黃素能降低小鼠血清肝酶及肝細(xì)胞釋放的肝酶,改善NAFLD單純性肝脂肪變性階段由脂質(zhì)沉積肝細(xì)胞導(dǎo)致的肝細(xì)胞受損。
   3.大黃素能減少血清FFA,降

15、低血清TG、TC、LDL-C,增加HDL-C,糾正血脂紊亂??赡軝C(jī)制是通過減少進(jìn)入肝細(xì)胞游離脂肪酸,從而降低肝臟甘油三酷合成,減輕過量FFA的毒性作用,逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪沉積,改善肝功能,保護(hù)肝細(xì)胞。
   4.大黃素能增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力,減少活性氧及自由基的產(chǎn)生,抑制脂質(zhì)過氧化,減輕肝臟炎癥及脂肪肝進(jìn)展。其機(jī)制可能是通過減少循環(huán)中血清FFA,減少肝細(xì)胞FFA的攝入,從而減輕線粒體氧化負(fù)荷,改善線粒體β氧化,減少活性氧及自由基的產(chǎn)生。

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