補(bǔ)腎中藥誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞方向分化的研究.pdf

1、【目的】
　　研究補(bǔ)腎中藥單體及復(fù)方含藥鼠血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為卵母細(xì)胞的影響。
　　【方法】
　　1、實(shí)驗(yàn)一補(bǔ)腎中藥單體齊墩果酸對(duì)mESC定向誘導(dǎo)的方法
　　選擇R1/E、1B10和D3三種不同小鼠品系小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，誘導(dǎo)mESC形成擬胚體（EB），以終濃度齊墩果酸分別干預(yù)三組EB分化，維甲酸為陽(yáng)性對(duì)照組，二甲基亞砜為空白對(duì)照組，于37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

2、學(xué)變化。3d后提取細(xì)胞RNA，合成cDNA，利用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光法（qPCR）檢測(cè)三種細(xì)胞各組生殖分化相關(guān)的基因Oct4、Gdf9、Scp3、Mvh、Zp1、Zp2、Zp3表達(dá)水平的變化；
　　2、實(shí)驗(yàn)二補(bǔ)腎中藥復(fù)方含藥血清對(duì)mESC定向誘導(dǎo)的方法
　　選擇1B10為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，誘導(dǎo)mESC形成EB，以終濃度5%1＃、2＃、3＃、5＃、10＃含藥血清干預(yù)EB，以5%空白血清作為對(duì)照，以control組（即無(wú)血清添加）為空白

3、對(duì)照。于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液，收集各組細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。鏡下觀察mESC形態(tài)變化時(shí)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證含藥鼠血清干預(yù)后的細(xì)胞是否具有GDF9、SCP3、ZP3三種卵母細(xì)胞標(biāo)識(shí)蛋白的表達(dá)；利用qPCR檢測(cè)定量觀察含藥鼠血清干預(yù)后第3、5、8、11天細(xì)胞內(nèi)基因Oct4、Nanog、Prdm14、Blimp1、Tfap2c、Gdf9、Scp3、Zp3的表達(dá)；同時(shí)運(yùn)用雙抗體免疫酶聯(lián)反應(yīng)法（ELISA）測(cè)定含

4、藥鼠血清干預(yù)后每5、8、11、14天細(xì)胞內(nèi)生殖細(xì)胞標(biāo)志物GDF9、SCP3、ZP3含量的變化。
　　以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性，則采用_x±s表示，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
　　【結(jié)果】
　　1、實(shí)驗(yàn)一結(jié)果
　　與DMSO組相比較，齊墩果酸單體可上調(diào)R1/E中Scp3、Mvh、Zp1、Zp2基因表達(dá)（P＜0.01），上調(diào)1B10中Gdf9、Mvh、Zp2、Zp3基因

5、表達(dá)（P＜0.05）以及D3中Oct4、Gdf9、Scp3、Mvh、Zp1、Zp3基因表達(dá)（P＜0.05），促使R1/E、1B10及D3向生殖細(xì)胞方向分化；與DMSO組相比較，陽(yáng)性參照物維甲酸單體僅能上調(diào)R1/E中Mvh基因表達(dá)（P＜0.01）以及1B10中Gdf9、Mvh、Zp3基因表達(dá)（P＜0.01），而D3中各生殖基因表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　2、實(shí)驗(yàn)二結(jié)果
　　2.1五組含藥血清組，空白血清組及control組鏡下觀察均

6、可見(jiàn)分化后的mESC出現(xiàn)卵母細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)改變；
　　2.2各補(bǔ)腎中藥含藥鼠血清干預(yù)EB后，類卵細(xì)胞均能表達(dá)卵母細(xì)胞標(biāo)志物GDF9、ZP3及減數(shù)分裂標(biāo)志物SCP3，而空白血清組和control組則未能表達(dá)；
　　2.3五組含藥血清組均與空白血清組相比較，1＃含藥鼠血清干預(yù)EB后，在分化3d時(shí)Prdm14、Blimp1、Tfap2c、Scp3基因表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；3＃、5＃、10＃含藥鼠血清組于分化5-8d時(shí)Gdf9

7、、Scp3、Zp3基因表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）進(jìn)入分化活躍期；2＃含藥鼠血清在分化8d時(shí)各基因表達(dá)上調(diào)并出現(xiàn)峰值，可顯著促進(jìn)基因Prdm14、Blimp1、Gdf9、Scp3表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），五組含藥血清組均隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而各基因表達(dá)不同程度下降；
　　2.4與空白血清組相比較，不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞內(nèi)GDF9、SCP3、ZP3的蛋白含量測(cè)定顯示，除2＃含藥血清組于5d時(shí)細(xì)胞內(nèi)GDF9蛋白含量減少（P＜0.05）；1＃含藥血清組

8、于8d，2＃含藥血清組于8、11、14d時(shí)細(xì)胞內(nèi) SCP3含量減少（P＜0.01）；3＃含藥血清組全程，5＃含藥血清組于14d時(shí)細(xì)胞內(nèi)ZP3蛋白含量增加（P＜0.01）外，余各組三種蛋白含量均無(wú)顯著差異。
　　【結(jié)論】
　　1、補(bǔ)腎中藥單體及復(fù)方含藥血清均可定向誘導(dǎo)mESC向早期卵母細(xì)胞方向分化。
　　2、齊墩果酸單體定向誘導(dǎo)起效迅速但細(xì)胞凋亡較快，不適宜長(zhǎng)期體外干預(yù)；補(bǔ)腎中藥含藥鼠血清起效較緩但作用穩(wěn)定，更具有臨床意