FGF21對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 大多數(shù)情況下重組FGF21蛋白的體外表達(dá)是使用大腸桿菌表達(dá)體系，蛋白以不溶的包涵體形式表達(dá)，復(fù)性后才有生物活性，復(fù)性的蛋白半衰期短，穩(wěn)定性差，因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，提出了復(fù)性修飾一步法來獲得活性較高，穩(wěn)定性好的PEG-FGF21。又由于近年來隨著生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率也隨之增加，因其致死致殘率很高，因此嚴(yán)重危害著人類健康。ROS是指活性氧，當(dāng)活性氧持續(xù)增加超過了機(jī)體細(xì)胞的清除能力時，就會產(chǎn)生氧化

2、應(yīng)激。氧化應(yīng)激與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。FGF21是新發(fā)現(xiàn)的成纖維生長因子超家族一個新成員，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FGF21是一種重要的代謝調(diào)節(jié)因子，對糖脂代謝有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來有關(guān)FGF21對糖尿病，肥胖，脂肪肝等諸多代謝性疾病的研究取得的進(jìn)展客觀，但是關(guān)于FGF21是否具有保護(hù)心肌細(xì)胞作用的研究還不多見。本實(shí)驗(yàn)主要研究FGF21對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用及其保護(hù)作用的具體機(jī)制。
　　 方法:
　

3、　 1、用8M的尿素使FGF21變性，稀釋復(fù)性，復(fù)性同時加PEG修飾劑修飾FGF21。
　　 2、用陰離子交換柱對復(fù)性修飾后的PEG-FGF21進(jìn)行純化。
　　 3、通過圓二色譜對復(fù)性修飾后的PEG-FGF21進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　 4、檢測PEG-FGF21促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞對糖吸收的作用。
　　 5、體外用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞。
　　 6、建立H2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋

4、亡的模型。
　　 7、檢測FGF21、PEG-FGF21對H2O2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的影響。
　　 8、用hoeschst染色，熒光顯微鏡觀察不同處理組的染色情況。
　　 9、流式細(xì)胞儀檢測FGF21對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響。
　　 10、westemblot檢測不同處理組caspase3的表達(dá)變化。
　　 11、方法同第6步分別檢測AKT、p-akt、gsk、p-gsk、IKB、

5、caspase3的表達(dá)變化趨勢，actin作內(nèi)參。
　　 12、用aktl/akt2的選擇性抑制劑western blot法檢測p-akt、p-gsk、caspase3的表達(dá)變化趨勢。
　　 13、用AKT的激動劑，gsk的抑制劑氯化鋰，western blot法檢測p-akt、p-gsk、caspase3的表達(dá)變化趨勢。
　　 結(jié)果:
　　 1、在PH值為6時修飾率達(dá)53％跟自然條件下的修飾率(56％)

6、相差不大，故選擇PH6為復(fù)性修飾的PH值。
　　 2、根據(jù)前期的研究，純化率較高。
　　 3、根據(jù)圓二色譜圖結(jié)果顯示復(fù)性修飾的PEG-FGF21比傳統(tǒng)的修飾的PEG-FGF21與FGF21的結(jié)構(gòu)更吻合。
　　 4、3T3-L1活性檢測得出一步修飾的FGF21活性較好。
　　 5、結(jié)果顯示400uM的H2O2作用2小時凋亡現(xiàn)象比較理想。
　　 6、CCK8法顯示FGF21對H2O2損傷下可以減少細(xì)胞

7、的死亡數(shù)。
　　 7、Hoechest染色結(jié)果顯示FGF21和PEG-FGF21處理組的細(xì)胞形態(tài)比H2O2處理組的細(xì)胞形態(tài)好。
　　 8、Western blot法證明FGF21、PEG-FGF21對在H2O2損傷下的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　 9、Annexin V/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示FGF21，PEG-FGF21處理組的凋亡數(shù)比單純H2O2處理組的凋亡數(shù)少。
　　 10、FGF21、PE