人參皂苷Rg1調控輻射導致造血干-祖細胞衰老的機理.pdf

1、實驗目的:
　　衰老相關研究是近年來生命科學的一個熱點，老年性疾病的高發(fā)率及社會人口老齡化進程的不斷加快，使得衰老相關機理的研究和延緩衰老的研究不再單單是一個醫(yī)學問題，更成為一個社會問題。機體最基本的構成單位和功能單位是細胞，而干細胞更是維持成熟且具有功能的組織和器官的穩(wěn)態(tài)的關鍵。因為干細胞具有高度的自我更新和增殖分化能力，所以在傳統(tǒng)觀念上它被認為是不朽的不會衰老的。然而當受到機體內部因素或者外部損傷因素的作用下，組織修復能力的降

2、低和癌癥的易感率的增高，表明干細胞可能發(fā)生著各種內外因素造成其損傷相關的功能下降甚至衰老。
　　造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）負責終身生產(chǎn)所有類型的血細胞，因此它位于機體造血系統(tǒng)地頂層，它的衰老不僅關系著造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，更有實驗證明HSC衰老與機體的衰老有密切的聯(lián)系。最近的研究報道，DNA損傷是導致成體干細胞數(shù)量減少和功能衰退的主要機制之一。事實上生物基因組的完整性受到內源性和外源性

3、多種損傷因素的影響，其中輻射致細胞DNA損傷的積累，是導致細胞衰老和疾病發(fā)生的一個重要因素。
　　幾千年傳承下來的祖國中醫(yī)醫(yī)學博大精深，如何將祖國傳統(tǒng)醫(yī)學與現(xiàn)代西醫(yī)合理有效的結合起來具有重要的意義同時也是本課題的創(chuàng)新所在。人參是祖國醫(yī)學的名貴藥材，它具有活血、補氣治療勞傷虛損的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明人參中提取的人參皂苷單體Rg1(ginsenoside Rg1)是其主要藥物活性成分之一。已有研究報道，人參及其提取物對細胞有輻射保護

4、作用。迄今，尚不清楚人參皂苷調控輻射所致造血干細胞衰老的機制。本實驗通過x射線全身照射(TBI)誘導小鼠造血干/祖細胞DNA損傷，進而探討電離輻射損傷導致的造血干細胞衰老過程中人參皂苷單體Rg1的抗衰老作用及其相關的調控機制。能夠為我們下一步尋找合適的途徑和時間點來對造血干細胞衰老進行有效的干預提供重要的理論及實踐依據(jù)。
　　實驗方法:
　　1.電離輻射誘導造血干細胞衰老模型構建:模型組，C57BL/6小鼠全身一次性）x線照

5、射，劑量為6.5GY;對照組:作假照射，采取于輻射組相同處理，但不進行照射。
　　2.模型小鼠衰老相關指標檢測:照射后第3、7、14、28天，分別觀察各組小鼠的行為表現(xiàn);采集外周血，檢測外周血象;脫頸處死小鼠后，取出脾臟測定脾指數(shù)，取兩側股骨及脛骨，沖出骨髓后計數(shù)骨髓單個核細胞及造血干細胞。
　　3.造血干/祖細胞的分離、純化與鑒定:將提取出的骨髓單個核細胞通過MACS分選得到標記細胞;流式檢測標記細胞中Sca-1+HSC/

6、HPC的百分比。臺酚藍染色檢測細胞存活率。
　　4.Sca-1+HSC/HPC衰老相關生物學檢測:SA-β-gal染色檢測細胞的衰老。增殖與分化能力通過混合性集落的(CFU-Mix)培養(yǎng)測定;流式細胞術測定其處于G1期阻滯的細胞比例。
　　5.單細胞凝膠電泳（彗星試驗）檢測造血干細胞DNA損傷情況。
　　6.Sca-1+HSC/HPC中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的檢測。
　　7.衰老相關基

7、因及其蛋白表達檢測:PCR檢測與衰老相關的基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/WaflmRNA的表達，Western blot檢測其蛋白的表達以研究Rg1延緩或治療Sca-1+HSC/HPC衰老與p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cip1/Wafl信號通路之間的關系實驗。
　　結果:
　　1.照射后的各時間點，模型組小鼠均表現(xiàn)為精神不振、行為遲緩，進食減少和毛色失潤等。外周血象下降明

8、顯。亞致死劑量照射后照射組小鼠單個股骨的骨髓單個核細胞數(shù)目及其分選后的Sca-1+HSC/HPC數(shù)目較假照射組均急劇下降。脾指數(shù)明顯降低。
　　2.免疫磁珠分離純化后，流式細胞術結果顯示Sca-1+細胞純度為93.66±0.83％。分選的Sca-1+細胞活性為96％～99％。
　　3.照射組Sca-1+HSC/HPC數(shù)量于照射后1d急劇下降，照射后3d耗竭至最低，照射后7d開始緩慢恢復。照射Rg1組Sca-1+HSC/HPC

9、數(shù)量于照射后1天大幅下降，照射后3d回升，照射后7d回升加快。
　　4.照射組分選后的Sca-1+HSC/HPC其SA-β-gal染色陽性率較假照射組顯著增加;照射Rg1組陽性率低于照射組。照射組混合性造血祖細胞集落形成數(shù)減少，集落細胞數(shù)少，照射Rg1組形成CFU-Mix的數(shù)量明顯較照射組明顯增加。流式細胞檢測顯示照射組細胞G0/G1期比例明顯增高;在照射后第3天和第7天照射Rg1組G1期細胞比例較照射組降低。
　　5.熒光

10、顯微鏡下觀察顯示，假照射組細胞核基本完整，呈圓形，細胞核染色體DNA未出現(xiàn)明顯遷移。而照射組中多數(shù)細胞DNA有明顯的彗星狀尾部，照射Rg1組的細胞也可見彗尾，但長度和面積均小于照射組。照射組的尾長和Olive尾矩均明顯大于假照射組和照射Rg1組。
　　6.與假照射組相比，照射組Sca-1+HSC/HPC的SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高;與照射組相比，照射Rg1組Sca-1+HSC/HPC SOD活性明顯升高，MDA含量明顯

11、降低。
　　7.全身一次性照射后1d，照射組造血干祖細胞的衰老相關基因(p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Wafl)mRNA表達水平顯著高于假照射組;照射Rg1組基因的mRNA的表達水平低于照射組8.Western blot結果顯示照射組造血干祖細胞的衰老相關基因p16INK4a，p19Arf，p53，p21Cip1/Wafl蛋白表達水平較假照射組明顯升高;照射Rg1組蛋白表達水平低于照射組。
　　結論