丹參素與半胱氨酸衍生物的綴合物對(duì)HUVECs和SH-SY5Ys的抗氧化和抗凋亡作用的機(jī)制的初步研究.pdf

1、[目的]丹參素作為中藥丹參中的有效成分，有著廣泛的生物活性，如擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抑制血小板聚集、抗心肌細(xì)胞凋亡和抗炎作用等，而這些作用至少部分與其抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。但是由于丹參素的羥基的化學(xué)不穩(wěn)定性，所以很難從天然產(chǎn)物中分離和純化丹參素，而且丹參素因?yàn)橹苄圆?，所以很難進(jìn)入細(xì)胞膜，因此我們?cè)谝延械难芯炕A(chǔ)上，我們將丹參素與半胱氨酸衍生物分子結(jié)合，以加強(qiáng)其穩(wěn)定性和脂溶性?；谝陨希覀?cè)O(shè)計(jì)并合成了化合物1，2，3，并測(cè)定其對(duì)H2O2刺激

2、的SH-SY5Ys和HUVECs的保護(hù)作用。
　　[方法]因化合物1，2為手性異構(gòu)體，而化合物3為消旋體，所以我們先分析化合物1，2，3的藥效和結(jié)構(gòu)差異的關(guān)系。首先，我們將SH-SY5Y細(xì)胞分為6組，分別為:陽(yáng)性藥組(NAC，5mM);化合物1、2、3組（50μM）;Model組以及Control組。將細(xì)胞種好后，部分細(xì)胞用50μM的化合物1，2，3和5mM的NAC預(yù)給藥4小時(shí)，然后將除了Control組之外的細(xì)胞用200μM的H

3、2O2刺激12小時(shí)。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用MTT和LDH法來測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，用光鏡法和Hoechst染色法來測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的凋亡的抑制作用，最后再用MDA法、SOD法、GSH法和Gpx免疫熒光染色法來測(cè)定藥物抗氧化作用。
　　而后，我們又用HUVEC細(xì)胞對(duì)化合物3進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制的研究，將HUVEC細(xì)胞分為6組，陽(yáng)性藥組(NAC，5mM)，5μM、50μM和100μM的化合物3組;Model組合Control組。將細(xì)胞種好后，部

4、分細(xì)胞用5μM、50μM和100μM化合物3以及NAC預(yù)給藥4小時(shí)，然后將除了Control組之外的細(xì)胞用200μM的H2O2刺激12小時(shí)。帶實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用MTT和LDH法來測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，用MDA和GSH法來測(cè)定藥物的抗氧化作用，用PI和V-FITC雙染和JC-1來測(cè)定藥物的抗凋亡作用。同時(shí)采用Western-Blot法來測(cè)定Bcl-2、bax、caspase3、 caspase9的凋亡通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。
　　[結(jié)果

5、]經(jīng)過對(duì)SH-SY5Y的研究，化合物1，2和3可以顯著的提高細(xì)胞的相對(duì)活性，降低細(xì)胞LDH的漏出率，降低MDA的含量，提高SOD和GSH的活性。而在免疫熒光染色檢測(cè)中，我們可以看到藥物可以提高Gpx的活性，而顯著提高細(xì)胞的存活率。而且在以上的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)化合物1，2和3的效果并無顯著性差異，而手性異構(gòu)體1，2比較難以獲得，因此我們將研究的重點(diǎn)放在消旋體化合物3上。在接下來對(duì)HUVEC細(xì)胞的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，化合物3在50，100μM

6、時(shí)，可以顯著提高細(xì)胞的相對(duì)活性并降低LDH的漏出率，并有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以顯著的減少細(xì)胞凋亡，并且使凋亡通路的蛋白bcl-2、pro-caspase3、pro-caspase9的含量顯著提高，使bax含量顯著降低。
　　[結(jié)論]本研究發(fā)現(xiàn)，化合1，2和3都有抗凋亡的作用，而且3者的抗凋亡作用無顯著性差異，而且3者的抗凋亡作用部分與3者的抗氧化作用有關(guān)。因此，我們認(rèn)為，化合物1，2和3有成為在抗凋亡藥物的潛質(zhì)。有期望在治療心腦血