MiR-101通過(guò)調(diào)控ZEB1和ZEB2抑制漿液性卵巢癌EMT的研究.pdf

1、卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤;大多數(shù)病人在確診后5年內(nèi)死亡。預(yù)后差主要是由于多數(shù)病人確診時(shí)已是晚期，腫瘤大多已發(fā)生轉(zhuǎn)移。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要組成部分。通過(guò)對(duì)卵巢癌的整合性分析，我們發(fā)現(xiàn)了調(diào)控EMT過(guò)程的主要的microRNA(miRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括miR-101。本研究中，我們討論miR-101在EMT調(diào)控過(guò)程中的作用。通過(guò)熒

2、光素酶報(bào)告基因分析，我們證明miR-101通過(guò)直接抑制ZEB1和ZEB2的3'非編碼區(qū)(3'-untranslated region3'-UTR)，從而上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-101可顯著抑制EMT過(guò)程及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。過(guò)表達(dá)ZEB1或ZEB2基因，miR-101不能增加E-cadherin的表達(dá)。上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中miR-101的水平，miR-200家族無(wú)明顯變化。我們的研究表明miR-101可通過(guò)調(diào)控E-c

3、adherin的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，從而調(diào)控EMT過(guò)程，此過(guò)程不依賴于miR-200家族。
　　本研究分為四個(gè)部分進(jìn)行:
　　1.對(duì)TCGA數(shù)據(jù)中459例漿液性卵巢癌的DNA拷貝數(shù)變化，啟動(dòng)子甲基化及miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，識(shí)別TCGA中間質(zhì)表型基因表達(dá)譜。篩選7個(gè)漿液性卵巢癌細(xì)胞系，測(cè)定7個(gè)細(xì)胞系miR-101及E-cadherin的表達(dá)水平，檢查二者是否存在正相關(guān)。
　　2.將miR-101轉(zhuǎn)染進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系

4、，觀察外源性miR-101對(duì)卵巢癌細(xì)胞EMT、遷移及侵襲的影響。
　　3.構(gòu)建pmirGLO-ZEB1，pmirGLO-ZEB2質(zhì)粒和pmirGLO-ZEB13'-UTR-M1，pmirGLO-ZEB13'-UTR-M2以及pmirGLO-ZEB23'-UTR-M突變質(zhì)粒。檢測(cè)miR-101是否直接靶向調(diào)控ZEB1和ZEB2。檢測(cè)miR-101是否能夠下調(diào)ZEB1和ZEB2的水平。
　　4.分別使用2個(gè)針對(duì)不同作用位點(diǎn)的si

5、RNA下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中ZEB1或ZEB2蛋白的表達(dá)，觀察是否同轉(zhuǎn)染miR-101后的效果相似。構(gòu)建ZEB1和ZEB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ZEB1和pcDNA3.1(+)-ZEB2，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。將miR-101轉(zhuǎn)染穩(wěn)定克隆細(xì)胞，觀察ZEB1和ZEB2的表達(dá)是否下調(diào)，E-cadherin表達(dá)水平是否依然升高，以證實(shí)miR-101對(duì)EMT的抑制作用是由ZEB1和ZEB2介導(dǎo)的。
　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，可

6、以得出以下幾個(gè)結(jié)論:
　　1.對(duì)TCGA數(shù)據(jù)中459例漿液性卵巢癌進(jìn)行整合分析，將其分為上皮亞型(iE)和間質(zhì)亞型(iM)，后者與預(yù)后差相關(guān)。8個(gè)miRNAs(miR-25，miR-506，miR-29c，miR-182，miR-128，miR-101，miR-141，and miR-200a)可調(diào)控89％的miRNA相關(guān)基因，且在iM中的表達(dá)低于iE。miR-101在iM亞型中低表達(dá)和DNA拷貝數(shù)缺失有關(guān)。MiR-101在上皮性

7、卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于間質(zhì)性細(xì)胞系。
　　2.MiR-101可以顯著增加上皮標(biāo)志物E-cadherin的水平，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin，N-cadherin及Vimentin，改變卵巢癌細(xì)胞形態(tài)，抑制卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。
　　3.MiR-101通過(guò)與ZEB1和ZEB2的3'UTR種子序列特異性結(jié)合，直接調(diào)控二者的表達(dá)，從而抑制卵巢癌EMT過(guò)程。
　　4.MiR-101上調(diào)E-cadherin，抑