多發(fā)性硬化及視神經(jīng)脊髓炎的遺傳學(xué)與免疫學(xué)特點(diǎn)以及軸突損害評(píng)估與保護(hù)的研究.pdf

1、目的： 1.探索AQP4啟動(dòng)子區(qū)基因的多態(tài)性，并探討其與我國(guó)多發(fā)性硬化(MS)及視神經(jīng)脊髓炎(NMO)患者遺傳易感性的關(guān)系，從遺傳學(xué)角度對(duì)MS及NMO進(jìn)行鑒別。 2.研究MS及NMO患者血清和腦脊液VEGF水平及腦脊液αB晶狀體蛋白的差異，并探討其與臨床、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，從免疫學(xué)角度對(duì)MS與NMO進(jìn)行鑒別。 3.研究MS、NMO及臨床孤立綜合征(CIS)患者腦脊液sAPP、Aβ42水平的差異，及其與臨床

2、、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，探討APP對(duì)MS、NMO軸突損害評(píng)估及早期推測(cè)病情預(yù)后的作用。 4.研究MS、NMO及CIS患者血清及腦脊液BDNF、GDNF水平的差異，及其與臨床、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，探討B(tài)DNF、GDNF對(duì)MS、NMO的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法：對(duì)124例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的MS、NMO及CIS患者及78例對(duì)照組進(jìn)行研究，其中MS患者分為OSMS及CMS兩組。對(duì)所有MS、NMO及CIS患者復(fù)發(fā)期及緩解期進(jìn)行E

3、DSS評(píng)分，對(duì)95例MS、NMO及CIS患者進(jìn)行頭顱、脊髓及視神經(jīng)MRI檢查，5例MS患者進(jìn)行了MRS及DTI檢查，對(duì)109例MS、NMO及CIS患者進(jìn)行了血清及腦脊液寡克隆帶定量、定性測(cè)定。用酚/氯仿抽提法從患者及健康對(duì)照組全血標(biāo)本中提取DNA，PCR擴(kuò)增AQP4啟動(dòng)子區(qū)基因(AQP4-Promoter0和AQP4-Promoter1基因)，再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測(cè)序，通過(guò)與GenBank公布的人類AQP4基因序列比較，尋找陽(yáng)性突變

4、位點(diǎn)。應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)患者及對(duì)照組腦脊液中的sAPP及αB晶狀體蛋白；用液相芯片分析技術(shù)檢測(cè)血清及腦脊液BDNF、GDNF、VEGF、Aβ42濃度；用ELISA法檢測(cè)腦脊液αsAPP濃度。 結(jié)果： 1.成功擴(kuò)增并測(cè)定了80例患者(其中NMO8例、MS47例、CIS25例)和39例對(duì)照組的AQP4啟動(dòng)子區(qū)基因序列，共發(fā)現(xiàn)14個(gè)AQP4-promoter0陽(yáng)性突變位點(diǎn)及6個(gè)AQP4-promoter1陽(yáng)性突

5、變位點(diǎn)。其中，MS患者AQP4-promoter0的-1003bp位點(diǎn)突變率(A突變?yōu)镚)比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)；NMO及MS患者AQP4-promoter1的—401bp與—400bp位點(diǎn)之間的突變率(插入1個(gè)C)均比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027和0.01)。 2.有AQP4啟動(dòng)子區(qū)基因突變的MS患者出現(xiàn)MRI下丘腦病灶的概率比無(wú)基因突變的MS患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。

6、 3.NMO、MS及CIS患者發(fā)作期腦脊液VEGF平均熒光強(qiáng)度比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015、0.016及0.02)，但NMO與MS、CMS與OSMS患者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 4.BBB指數(shù)升高組及Tourtellotte合成率升高組NMO及MS患者血清VEGF濃度比上述指標(biāo)正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0037及0.021)。 5.Western—Blot結(jié)果顯示，NMO、MS、

7、CIS患者及對(duì)照組腦脊液中均可檢測(cè)到分子量為110Kda及22Kda(分別與sAPP及αB晶狀體蛋白分子量相同)的條帶，各組條帶的灰度強(qiáng)弱無(wú)明顯差異。 6.NMO、MS、CIS和對(duì)照組腦脊液αsAPP與Aβ42濃度呈正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)為0.37，P=0.011，Kendall's tua—b相關(guān)系數(shù)為0.265，P=0.009)，腦脊液αsAPP濃度與EDSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)為—0.3

8、71，P=0.004；Kendall's tua—b相關(guān)系數(shù)為—0.258，P=0.007)，EDSS≥4.5分組患者腦脊液αsAPP濃度比EDSS<4.5分組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。 7.他汀類藥物治療組患者腦脊液αsAPP水平比無(wú)使用該藥治療組患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。 8.MS患者腦脊液BDNF濃度比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)；血清與腦脊液BDNF濃度不相關(guān)(Pe

9、arson相關(guān)系數(shù)為—0.255，P=0.091)。 9.腦脊液BDNF與GDNF濃度呈正相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)為0.624，P<0.01；Kendall's tua—b相關(guān)系數(shù)為0.494，P<0.01)。 10.血清GDNF濃度與EDSS評(píng)分呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)為0.303，P=0.025；Kendall's tua—b相關(guān)系數(shù)為0.203，P=0.038)，EDSS≥4.5分的患者血清GD

10、NF濃度比EDSS<4.5分的患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)。 11.腦脊液BDNF、GDNF均與Aβ42呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.251及0.420，P<0.05；Kendall's tua—b相關(guān)系數(shù)分別為0.179及0.308，P<0.05)。 12.10名有MRI結(jié)果的NMO患者中，有4名(40％)發(fā)現(xiàn)有腦部MRI病灶，均為非特異的皮質(zhì)下白質(zhì)改變；5名行MRS檢查的MS患者均顯示病灶

11、區(qū)NAA含量下降，且與腦脊液αsAPP水平升高相關(guān)。 結(jié)論： 1.成功完成了AQP4啟動(dòng)子區(qū)基因的擴(kuò)增及DNA序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了14個(gè)AQP4-promoter0陽(yáng)性突變位點(diǎn)及6個(gè)AQP4-promoter1陽(yáng)性突變位點(diǎn)。其中，AQP4-promoter0中-1003bp位點(diǎn)的突變(A突變?yōu)镚)以及AQP4-promorter1中—401bp與—400bp位點(diǎn)之間的突變(插入1個(gè)C)與MS、NMO易感性有關(guān)。AQP4啟動(dòng)子

12、區(qū)基因突變與MS患者M(jìn)RI下丘腦病灶可能有一定的關(guān)系。 2.NMO、MS患者發(fā)作期腦脊液VEGF水平比對(duì)照組高，但與臨床分型無(wú)關(guān)。血清VEGF濃度與MS病灶中BBB破壞的形成及CNS內(nèi)IgG合成有關(guān)。 3.sAPP及αB晶狀體蛋白在NMO、MS、CIS患者及對(duì)照組腦脊液中均存在，各組含量未見(jiàn)明顯差異。 4.腦脊液αsAPP水平與NMO、MS患者神經(jīng)功能殘疾及MRS中NAA含量下降相關(guān)。腦脊液αsAPP及Aβ42濃

13、度呈正相關(guān)，二者可能均可用于MS軸突損傷的評(píng)估。他汀類藥物可能通過(guò)提高腦脊液αsAPP水平對(duì)NMO及MS患者具有神經(jīng)保護(hù)作用。 5.MS患者腦脊液BDNF濃度比對(duì)照組高，可能是CNS損傷后機(jī)體的一種代償機(jī)制。血清與腦脊液BDNF濃度不相關(guān)，提示二者來(lái)源可能不同。MS、NMO患者腦脊液BDNF與GDNF水平呈正相關(guān)關(guān)系，二者對(duì)神經(jīng)保護(hù)可能具有協(xié)同作用。血清及腦脊液BDNF、GDNF水平與NMO、MS患者神經(jīng)功能殘疾及軸突損傷相關(guān)。