神經(jīng)節(jié)苷脂對缺氧缺血性新生大鼠認(rèn)知功能改善的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景和目的
   新生兒缺氧缺血性腦病是新生兒神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一?;純嚎沙霈F(xiàn)激惹、肌張力增高、嗜睡和抽搐等癥狀,嚴(yán)重者可致昏迷甚至死亡。即使存活下來,如不及時(shí)治療,也會造成嚴(yán)重的后遺癥(如生長發(fā)育落后、學(xué)習(xí)記憶能力下降和癲癇等)。其發(fā)病機(jī)制主要包括能量代謝障礙、興奮性氨基酸過度激活、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、以及細(xì)胞凋亡等。其中興奮性氨基酸過度激活引起的神經(jīng)毒性成為人們研究的熱點(diǎn)方向。
   興奮性氨基酸與其特異性受體(主要為

2、NMDA受體)結(jié)合后,可以發(fā)揮其獨(dú)特的作用。在生理狀況下可以介導(dǎo)適度的Ca2+內(nèi)流,誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)的形成,而突觸后長時(shí)程增強(qiáng)的形成與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。其過度激活后可以導(dǎo)致Ca2+大量內(nèi)流,激活并放大由Ca2+作為第二信使的傳導(dǎo)通路,產(chǎn)生一系列病理性的改變,最終可導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死和凋亡。NMDA受體由不同結(jié)構(gòu)的亞單位組成,在海馬區(qū)主要是NR1和NR2B。NR1亞單位主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流,NR2B亞單位被證實(shí)與突觸后形成的長時(shí)程增

3、強(qiáng)密切相關(guān),參與學(xué)習(xí)、記憶能力的形成。
   缺氧缺血造成的細(xì)胞凋亡可以在發(fā)病后持續(xù)存在,是后期神經(jīng)元喪失的主要原因。線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中樞,細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放后引起的凋亡是細(xì)胞內(nèi)凋亡產(chǎn)生的主要途徑。
   神經(jīng)節(jié)苷脂作為一種營養(yǎng)神經(jīng)類藥物,現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療缺氧缺血性腦病。但關(guān)于其改善缺氧缺血后認(rèn)知功能障礙方面的研究很少,本課題通過建立缺氧缺血動物模型了解神經(jīng)節(jié)苷脂干預(yù)下海馬CA1區(qū)中NMDA受體NR1、NR

4、2B和細(xì)胞色素C的表達(dá)變化,探討神經(jīng)節(jié)苷脂改善認(rèn)知功能和保護(hù)神經(jīng)的機(jī)
   制。
   材料和方法:
   1模型的制作和分組
   7日齡新生SD大鼠60只隨機(jī)分為三組:A組模型組;B組神經(jīng)節(jié)苷脂干預(yù)組;C組空白對照組。A組B組標(biāo)號后經(jīng)稱量體重,置入有乙醚的燒杯中,吸入麻醉后,取仰臥位后固定于手術(shù)板上,常規(guī)消毒后,行頸前正中線切口,游離左頸總動脈,用絲線結(jié)扎,縫合切口,放回原窩中休息1小時(shí),置于缺氧箱中

5、,通入(8%O2+92%N2)的氮氧混合氣體2小時(shí),制成缺氧缺血大鼠模型。C組僅分離出左側(cè)總動脈,不結(jié)扎動脈也不吸入氧氮混合氣體。上述三組動物飼養(yǎng)方式相同。
   2藥物應(yīng)用和制作標(biāo)本
   B組大鼠在缺氧缺血后即刻腹腔注射神經(jīng)節(jié)苷脂(30mg/kg),以后每天腹腔注射1次,持續(xù)七天;給予A組大鼠腹腔注射生理鹽水(30ml/kg),保證注射時(shí)間和注射量相同;對C組大鼠不注射任何試劑。于第八天從三組中隨機(jī)選擇10只新生大鼠

6、處死,心臟灌注后快速將大腦解剖后分離,甲醛固定,常規(guī)脫水后用石蠟包埋,做連續(xù)冠狀切片備檢。
   3指標(biāo)觀察
   各組組織切片均做免疫組織化學(xué)染色觀察NMDA受體NR1、NR2B及細(xì)胞色素C的表達(dá)變化,使用TUNEL法測定凋亡細(xì)胞數(shù)。剩余的大鼠于術(shù)后第28天行迷宮實(shí)驗(yàn)測試,觀察并記錄大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。
   4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
   用SPSS13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)

7、表示,采用單因素方差分析法進(jìn)行比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。馇甲
   結(jié)果:
   1學(xué)習(xí)和記憶能力比較
   A組大鼠第1天和第2天達(dá)標(biāo)所需反應(yīng)次數(shù)都明顯多于C組(P<0.05)和B組(P<0.05),正確反應(yīng)率也都明顯低于C組(P<0.05)和B組(P<0.05)。B組第1天和第2天達(dá)標(biāo)所需反應(yīng)次數(shù)仍都明顯多于C組(P<0.05),正確反應(yīng)率也仍都明顯低于C組(P<0.05)。
   2

8、NRI、NR2B和細(xì)胞色素C免疫組織化學(xué)的表達(dá)
   在光鏡下NR1陽性神經(jīng)元胞膜呈棕褐色,A組中NR1陽性神經(jīng)元著色最深,可見部分胞核染色;C組中表達(dá)NR1陽性神經(jīng)元數(shù)量最少,染色淺;B組介于二者之間。各組陽性區(qū)平均灰度值為(153.23±6.31,115.82±10.43,130.35±4.29,P<0.01),三組間陽性區(qū)的平均灰度值均有顯著性差異。
   NR2B表達(dá)狀況B組和C組中可見到大量細(xì)胞的胞膜被染成褐色

9、;A組神經(jīng)元中染色較淺,且神經(jīng)元數(shù)目較少。各組陽性區(qū)平均灰度值為(147.86±14.85,142.76±7.11,113.27±9.50),B組和C組中的NR2B陽性區(qū)的平均灰度值明顯高于A組(P<0.01),B組和C組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.148)。
   C組中表達(dá)細(xì)胞色素C陽性的細(xì)胞很少,A組中可見大量被染成棕色的表達(dá)細(xì)胞色素C的細(xì)胞,B組中表達(dá)陽性的細(xì)胞明顯減少,陽性區(qū)平均灰度值為(113.00±7.27,152.

10、55±7.14,127.55±5.83),三者的表達(dá)均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
   3細(xì)胞凋亡
   C組中只有零星的凋亡細(xì)胞,A組可見大量凋亡細(xì)胞,B組中凋亡細(xì)胞較A組明顯減少,三組間的凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比有顯著性差異(依次為5.12±1.32,59.23±2.73,30.15±3.26,P<0.01)。
   結(jié)論:
   1、神經(jīng)節(jié)苷脂可以改善缺氧缺血性大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能是通

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