魚類精子中神經(jīng)節(jié)苷脂含量測定及冷凍對其的影響.pdf

1、脂類是組成細(xì)胞的重要組成成分，它在生物體維持正常的新陳代謝和生殖過程中，起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。精子作為生物體中一種特殊的細(xì)胞，脂類在構(gòu)成精子的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能的完整性上發(fā)揮著不可或缺的作用。精子膜脂類是構(gòu)成精子細(xì)胞膜液態(tài)鑲嵌結(jié)構(gòu)的主要成分，與維持成熟精子的生物膜穩(wěn)定有密切關(guān)系，同時(shí)也為受精而建立必要的分子構(gòu)型。另外，通過對哺乳動物精子冷凍前后膜脂質(zhì)的檢測發(fā)現(xiàn)，精子膜脂質(zhì)對精子活力的改變有重要作用。
　　通過對哺乳類動物精子的研究發(fā)

2、現(xiàn)，精子細(xì)胞中所含有的脂類主要由磷脂、中性脂、糖脂三部分組成，不同種類動物精子細(xì)胞脂類組成和含量存在差異;相同種類動物的精子細(xì)胞脂類在不同時(shí)期和精子不同部位也存在差異。
　　糖脂分為鞘糖脂（如腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂）和甘油糖脂（如單半乳糖基二酰基甘油、雙半乳糖節(jié)日酰基甘油）。神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)是大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞膜的組成成分，是大腦形成記憶的最重要物質(zhì)。神經(jīng)節(jié)苷脂因其最早被發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞而得名，是一類含唾液酸的鞘糖

3、脂，是由親水的寡糖鏈和親脂的神經(jīng)酰胺兩部分組成。
　　神經(jīng)節(jié)苷脂（Ganglioside，簡稱GM）是一種復(fù)合糖脂，存在于哺乳動物細(xì)胞，特別是神經(jīng)元細(xì)胞的胞膜中，是神經(jīng)細(xì)胞膜的天然組成部分。神經(jīng)節(jié)苷脂參與神經(jīng)元的生長、分化和表型的表達(dá)以及細(xì)胞遷移和神經(jīng)生長錐的定向延伸，具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)修復(fù)雙重作用，能從多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，對多種臨床上的神經(jīng)損傷有很好的修復(fù)作用。
　　神經(jīng)節(jié)苷脂的功能大致可歸納為以下幾種:1.

4、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞及大腦組織的正常發(fā)育，防治腦癱等疾病;2.修復(fù)損傷神經(jīng)及大腦組織，防治腦中風(fēng);3.增強(qiáng)記憶功能;4.延緩神經(jīng)細(xì)胞的衰老，防治帕金森、老年癡呆等疾病。
　　但是神經(jīng)節(jié)苷脂在腦組織中的含量較低，現(xiàn)有的分離提純方法大多步驟繁多，過程太過復(fù)雜，周期也較長，成本較高，從而導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)苷脂類藥物價(jià)格昂貴，因此探索一種簡便、精煉的提純方法，降低生產(chǎn)成本，具有非常重要的意義。
　　本實(shí)驗(yàn)主要以生物黃顙魚的精子為實(shí)驗(yàn)材料，首先建立了

5、用柱前衍生-高效液相色譜法檢測魚類精子中GM1（神經(jīng)節(jié)苷脂）含量的的方法。具體做法是魚類精子樣品經(jīng)氯仿-甲醇(1∶1)萃取再經(jīng)過對溴苯甲酰甲基溴衍生處理后，用HPLC-UV測定。然后檢測了鮸魚、大黃魚、黃姑魚、孔雀魚、鯉魚和黃顙魚這六種魚類精子中冷凍前后神經(jīng)節(jié)苷脂含量并做分析。
　　魚類精子中神經(jīng)節(jié)苷脂含量測定方法的建立。本實(shí)驗(yàn)在大量閱讀神經(jīng)節(jié)苷脂含量測定的文獻(xiàn)以后，再次優(yōu)化檢測方法。本文用超聲破碎的方法對精子細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后通

6、過兩種不同的有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行提脂，然后經(jīng)過對溴苯甲酰甲基溴處理以后，氮吹干，用HPLC-UV測定。通過對流動相的組成，前處理?xiàng)l件，檢測波長等方面的篩選，最終確定神經(jīng)節(jié)苷脂的檢測的方法是:每1ml精子懸液（精子濃度1.0×108個(gè)/ml左右）中加入2ml三氯甲烷，2ml甲醇，然后用超聲波破碎儀對精子細(xì)胞進(jìn)行破碎，具體操作條件是，樣品體積1ml的情況下，輸出功率為40％，超聲時(shí)間為4×15s，間隔時(shí)間為30s。這里需要注意的是，在超聲的過

7、程中，必須保證樣品置于冰水混合浴中，這是為了防止溫度過高而將脂類氧化。超聲結(jié)束后，加入1ml三氯甲烷溶液，充分混勻后。最后加入1ml甲醇震蕩30s，靜置清晰分層后取上層有機(jī)相置于具塞玻璃試管中。
　　神經(jīng)節(jié)苷脂樣品的衍生及檢測:將經(jīng)過上述處理所得的提取液用氮吹儀在氮?dú)饬髦芯徛蹈?，然后用移液槍加?ml對溴苯甲酰甲基溴的二甲基甲酰胺溶液，蓋上試管塞，于60攝氏度水浴中反應(yīng)60min，溶液經(jīng)過0.45μm有機(jī)相的濾膜過濾，液相色譜進(jìn)

8、樣進(jìn)行分析。分析的條件如下:
　　Extend-C18(4.6×100 mm，5μm)反相柱，甲醇-乙腈(80∶20)等梯度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫25攝氏度，檢測波長:260nm，進(jìn)樣量20μl
　　鮸魚、黃姑魚和大黃精子冷凍前后脂質(zhì)檢測及與低溫冷凍的相關(guān)性。采用優(yōu)化后的方案對上述魚類精子樣品進(jìn)行檢測。鮸魚，黃姑魚，和大黃魚精子中鮮精的神經(jīng)節(jié)苷脂的含量分別是14.1、31.09、25.24μg/108 sperm

9、，采用各自適宜的冷凍方案冷凍以后，神經(jīng)節(jié)苷脂的含量分別變?yōu)?.14、8.01、14.32μg/108sperm。鯉魚鮮精中神經(jīng)節(jié)苷脂的含量為35.24μg/108 sperm，采用適宜的冷凍方案冷凍以后，神經(jīng)節(jié)苷脂的含量變?yōu)?6.01μg/108sperm。黃顙魚和孔雀魚鮮精中神經(jīng)節(jié)苷脂含量分別為14.35、13.13μg/108sperm，對它們采取分別采取較好的冷凍方案后，神經(jīng)節(jié)苷脂的含量變?yōu)?.39、10.41μg/108sper