神經(jīng)節(jié)苷脂對缺氧缺血性新生大鼠認知功能改善的研究.pdf

1、背景和目的
　　 新生兒缺氧缺血性腦病是新生兒神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一?；純嚎沙霈F(xiàn)激惹、肌張力增高、嗜睡和抽搐等癥狀，嚴重者可致昏迷甚至死亡。即使存活下來，如不及時治療，也會造成嚴重的后遺癥(如生長發(fā)育落后、學習記憶能力下降和癲癇等)。其發(fā)病機制主要包括能量代謝障礙、興奮性氨基酸過度激活、細胞內(nèi)鈣超載、以及細胞凋亡等。其中興奮性氨基酸過度激活引起的神經(jīng)毒性成為人們研究的熱點方向。
　　 興奮性氨基酸與其特異性受體(主要為

2、NMDA受體)結合后，可以發(fā)揮其獨特的作用。在生理狀況下可以介導適度的Ca2+內(nèi)流，誘導長時程增強的形成，而突觸后長時程增強的形成與學習記憶能力密切相關。其過度激活后可以導致Ca2+大量內(nèi)流，激活并放大由Ca2+作為第二信使的傳導通路，產(chǎn)生一系列病理性的改變，最終可導致神經(jīng)元的壞死和凋亡。NMDA受體由不同結構的亞單位組成，在海馬區(qū)主要是NR1和NR2B。NR1亞單位主要介導細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，NR2B亞單位被證實與突觸后形成的長時程增

3、強密切相關，參與學習、記憶能力的形成。
　　 缺氧缺血造成的細胞凋亡可以在發(fā)病后持續(xù)存在，是后期神經(jīng)元喪失的主要原因。線粒體是調(diào)控細胞凋亡的中樞，細胞色素C從線粒體內(nèi)釋放后引起的凋亡是細胞內(nèi)凋亡產(chǎn)生的主要途徑。
　　 神經(jīng)節(jié)苷脂作為一種營養(yǎng)神經(jīng)類藥物，現(xiàn)已應用于臨床治療缺氧缺血性腦病。但關于其改善缺氧缺血后認知功能障礙方面的研究很少，本課題通過建立缺氧缺血動物模型了解神經(jīng)節(jié)苷脂干預下海馬CA1區(qū)中NMDA受體NR1、NR

4、2B和細胞色素C的表達變化，探討神經(jīng)節(jié)苷脂改善認知功能和保護神經(jīng)的機
　　 制。
　　 材料和方法：
　　 1模型的制作和分組
　　 7日齡新生SD大鼠60只隨機分為三組：A組模型組；B組神經(jīng)節(jié)苷脂干預組；C組空白對照組。A組B組標號后經(jīng)稱量體重，置入有乙醚的燒杯中，吸入麻醉后，取仰臥位后固定于手術板上，常規(guī)消毒后，行頸前正中線切口，游離左頸總動脈，用絲線結扎，縫合切口，放回原窩中休息1小時，置于缺氧箱中

5、，通入(8％O2+92％N2)的氮氧混合氣體2小時，制成缺氧缺血大鼠模型。C組僅分離出左側總動脈，不結扎動脈也不吸入氧氮混合氣體。上述三組動物飼養(yǎng)方式相同。
　　 2藥物應用和制作標本
　　 B組大鼠在缺氧缺血后即刻腹腔注射神經(jīng)節(jié)苷脂(30mg/kg)，以后每天腹腔注射1次，持續(xù)七天；給予A組大鼠腹腔注射生理鹽水(30ml/kg)，保證注射時間和注射量相同；對C組大鼠不注射任何試劑。于第八天從三組中隨機選擇10只新生大鼠

6、處死，心臟灌注后快速將大腦解剖后分離，甲醛固定，常規(guī)脫水后用石蠟包埋，做連續(xù)冠狀切片備檢。
　　 3指標觀察
　　 各組組織切片均做免疫組織化學染色觀察NMDA受體NR1、NR2B及細胞色素C的表達變化，使用TUNEL法測定凋亡細胞數(shù)。剩余的大鼠于術后第28天行迷宮實驗測試，觀察并記錄大鼠的學習及記憶能力。
　　 4統(tǒng)計學分析
　　 用SPSS13.0軟件系統(tǒng)進行結果處理，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)

7、表示，采用單因素方差分析法進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。馇甲
　　 結果：
　　 1學習和記憶能力比較
　　 A組大鼠第1天和第2天達標所需反應次數(shù)都明顯多于C組(P<0.05)和B組(P<0.05)，正確反應率也都明顯低于C組(P<0.05)和B組(P<0.05)。B組第1天和第2天達標所需反應次數(shù)仍都明顯多于C組(P<0.05)，正確反應率也仍都明顯低于C組(P<0.05)。
　　 2

8、NRI、NR2B和細胞色素C免疫組織化學的表達
　　 在光鏡下NR1陽性神經(jīng)元胞膜呈棕褐色，A組中NR1陽性神經(jīng)元著色最深，可見部分胞核染色；C組中表達NR1陽性神經(jīng)元數(shù)量最少，染色淺；B組介于二者之間。各組陽性區(qū)平均灰度值為(153.23±6.31，115.82±10.43，130.35±4.29，P<0.01)，三組間陽性區(qū)的平均灰度值均有顯著性差異。
　　 NR2B表達狀況B組和C組中可見到大量細胞的胞膜被染成褐色

9、；A組神經(jīng)元中染色較淺，且神經(jīng)元數(shù)目較少。各組陽性區(qū)平均灰度值為(147.86±14.85，142.76±7.11，113.27±9.50)，B組和C組中的NR2B陽性區(qū)的平均灰度值明顯高于A組(P<0.01)，B組和C組相比無統(tǒng)計學意義(P=0.148)。
　　 C組中表達細胞色素C陽性的細胞很少，A組中可見大量被染成棕色的表達細胞色素C的細胞，B組中表達陽性的細胞明顯減少，陽性區(qū)平均灰度值為(113.00±7.27，152.

10、55±7.14，127.55±5.83)，三者的表達均有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
　　 3細胞凋亡
　　 C組中只有零星的凋亡細胞，A組可見大量凋亡細胞，B組中凋亡細胞較A組明顯減少，三組間的凋亡細胞計數(shù)百分比有顯著性差異(依次為5.12±1.32，59.23±2.73，30.15±3.26，P<0.01)。
　　 結論：
　　 1、神經(jīng)節(jié)苷脂可以改善缺氧缺血性大鼠的學習記憶能力，其機制可能是通