幽門螺桿菌UreB抗原表位預(yù)測(cè)及其有效表位噬菌體展示的篩選.pdf

1、背景和目的：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是微需氧的革蘭陰性桿菌,呈螺旋狀.多數(shù)國(guó)家和地區(qū)Hp感染率高達(dá)50﹪以上,許多感染者都是無(wú)癥狀的,但是有部分感染者可出現(xiàn)急慢性胃炎和消化性潰瘍,Hp的持續(xù)性感染還與胃腺癌和胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān).Hp已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子.近年流行病學(xué)資料還發(fā)現(xiàn),幽門螺桿菌感染還與冠心病、動(dòng)脈硬化、血小板減少性紫癜、糖尿病、缺鐵性貧血、慢性特發(fā)性蕁麻疹、支氣管炎等發(fā)病有關(guān).

2、 尿素酶是Hp的一種重要毒力因子,它能夠?qū)⒛蛩胤纸獬蔀榘睔夂投趸?以中和胃部的酸性環(huán)境,有利于Hp的定植.尿素酶占細(xì)菌總蛋白的10﹪左右.尿素酶B亞基(UreB)是尿素酶的大亞基,且是尿素酶催化位點(diǎn)所在亞基.UreB在各螺桿菌屬間序列保守,且具有較強(qiáng)的抗原性,故吸引了較多學(xué)者研究基于UreB的疫苗.國(guó)內(nèi)外利用重組尿素酶B亞基研制疫苗均在一定程度上能引起免疫應(yīng)答,但無(wú)法在清除Hp效果上達(dá)成一致.只包含一種抗原蛋白的疫苗所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)

3、作用通常較弱,實(shí)際應(yīng)用可用性不高. 近年發(fā)展起來(lái)的含多個(gè)和多種抗原表位(epitope)的多抗原肽(multipleantigenic peptide,MAP)研究策略,極有可能成為解決亞基問題有效途徑.尋找有效的抗原表位是研制MAP的第一步.研究抗原表位可深層次地揭示蛋白抗原分子誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子機(jī)制及其特點(diǎn),并在研制新型分子疫苗、新型血清學(xué)檢測(cè)方法等方面有重要應(yīng)用前景.本研究擬篩選幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)分子中的

4、B以及Th細(xì)胞抗原表位,為研制多抗原肽(MAP)疫苗奠定基礎(chǔ). 實(shí)驗(yàn)方法：Ni-NTA親和層析法提純目的重組表達(dá)產(chǎn)物rUreB,常規(guī)皮內(nèi)免疫法制備兔抗血清.采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)UreB的B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析.選擇UreB主要B細(xì)胞和Th細(xì)胞聯(lián)合表位肽并融合表達(dá)于M13KE噬菌體PIll蛋白上,PEG/NaCI沉淀法提純重組噬菌體,SDS-PAGE鑒定目的重組Plll蛋白(rPlll).分別以自制備rUreB抗血清和

5、商品化抗Hp全菌IgG為一抗,采用Western blot對(duì)上述表位肽進(jìn)行鑒定和篩選. 結(jié)果：rUreB表達(dá)量約為細(xì)菌總蛋白的30﹪,提純后僅見單一蛋白條帶.免疫家兔后獲得抗血清.與GenBank中相關(guān)序列比較,本實(shí)驗(yàn)室的ureB基因核苷酸和氨基酸相似性分別為96﹪～99.5﹪和96﹪～100﹪.綜合預(yù)測(cè)結(jié)果,選擇4個(gè)同時(shí)含有Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位肽段UreB230、UreB322、UreB479和UreB527,并在M13噬菌體