水霉拮抗菌株的篩選與作用效果研究.pdf

1、水霉病為淡水養(yǎng)殖的常見病害，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？兹甘G在全球范圍內(nèi)的禁用，更加劇了水霉病的危害。然而抗生素類藥物在水產(chǎn)上易引起耐藥菌株的產(chǎn)生、藥物殘留等問題。生態(tài)防治是一個(gè)行之有效的途徑，能夠控制病原菌的數(shù)量，減少疾病的發(fā)生，同時(shí)還能改善養(yǎng)殖環(huán)境，維護(hù)微生態(tài)平衡。本著為水霉病生態(tài)防治益生菌開發(fā)提供候選菌株的目的，對(duì)水霉拮抗菌株進(jìn)行了篩選，并對(duì)其益生效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 為了獲得篩選用指示菌株——水霉病致病菌株，從感染

2、水霉病的史氏鱘肌肉組織分離獲得一株水霉菌株XJ001，其游動(dòng)孢子釋放方式為水霉屬方式，通過(guò)電鏡觀察第二孢孢子，表面有長(zhǎng)的帶鉤的毛紋飾，且第二孢孢子呈現(xiàn)間接萌發(fā)方式，XJ001不能產(chǎn)生有性結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些形態(tài)特征可將XJ001鑒定為寄生水霉(Saprolegnia parasitica)；采用人工攻毒感染異育銀鯽實(shí)驗(yàn)表明，異育銀鯽感染后出現(xiàn)了水霉典型白毛癥狀，死亡率高達(dá)83.3％，因此可以判定為水霉病的致病菌株。同時(shí)人工感染異育銀鯽水霉病方

3、法為研究拮抗菌對(duì)水霉病的防治效果提供了技術(shù)保障。 為了獲得水霉病病原的拮抗微生物，以水霉XJ001為指示病原菌，對(duì)其拮抗菌進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，從不同地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境中共分離得到了213株細(xì)菌，其中對(duì)水霉表現(xiàn)出抑制作用的有103株，能完全抑制水霉生長(zhǎng)的有11株。通過(guò)測(cè)定菌株溶血素的產(chǎn)生、培養(yǎng)1、2天后對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)抑制作用、菌體對(duì)水霉孢子萌發(fā)生長(zhǎng)抑制作用、無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液拮抗活性，對(duì)11株拮抗菌株進(jìn)行了復(fù)篩，K1、M3在各方面的拮抗

4、活性最為突出，且無(wú)溶血素產(chǎn)生。 選擇M3菌株，研究了菌體、無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的體外拮抗活性，并對(duì)M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的拮抗活性產(chǎn)生原因進(jìn)行了分析，研究了M3產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，平板抑制實(shí)驗(yàn)中，M3能夠顯著抑制水霉菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。M3菌落周圍形成清晰的抑菌圈，且抑制作用大小與M3培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，培養(yǎng)2d后產(chǎn)生的抑菌圈直徑為30mm，培養(yǎng)3d后的抑菌圈直徑為50mm，而陽(yáng)性對(duì)照中，真菌藥敏紙片咪康唑(10μg/片)對(duì)水霉形成的

5、抑菌圈直徑為14ram，1000ppm孔雀石綠形成的抑菌圈直徑為40mm。距離為30mm的M3菌線間，孢子的萌發(fā)完全受到抑制。M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液實(shí)驗(yàn)表明，瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)中，M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)沒有抑制作用；24孔板法實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液能夠顯著抑制水霉菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液原液及2倍無(wú)菌水稀釋液能夠完全抑制水霉菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)，與對(duì)照相比，5倍、10倍稀釋無(wú)菌發(fā)酵液顯著延緩了水霉菌絲的生長(zhǎng)，當(dāng)對(duì)

6、照組中的菌絲鋪滿整個(gè)孔徑時(shí)，5倍、10倍稀釋無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液組中水霉的菌絲長(zhǎng)度分別為2.3mm和7.6mm；對(duì)孢子而言，與對(duì)照組中86.3％的孢子萌發(fā)率相比，5倍、10倍稀釋無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液組中的孢子萌發(fā)率分別為18.2％和44％，且萌發(fā)后的菌絲生長(zhǎng)也受到抑制，5倍稀釋組中萌發(fā)后的菌絲在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未形成網(wǎng)狀，10倍稀釋組中的萌發(fā)后的菌絲在實(shí)驗(yàn)最后階段形成網(wǎng)狀，而對(duì)照組中萌發(fā)形成的菌絲則在實(shí)驗(yàn)后的20h時(shí)就呈現(xiàn)網(wǎng)狀了。水霉在pH為5～9的B

7、HI液體培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，而M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液的pH值為8.23，且用BHI液體培養(yǎng)基稀釋2倍后的M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液同樣能完全抑制水霉菌絲生長(zhǎng)，結(jié)果表明M3產(chǎn)生拮抗作用不是因?yàn)閜H值的改變及營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，而是產(chǎn)生了具有拮抗活性的物質(zhì)。采用二氯甲烷、乙醚兩種有機(jī)溶劑不能從M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液中提取出有拮抗活性的物質(zhì)；采用硫酸銨沉淀法也不能使拮抗活性物質(zhì)從M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液中有效分離出來(lái)。Fe2+對(duì)M3產(chǎn)生拮抗物質(zhì)量有一定的影響，當(dāng)培養(yǎng)基中的Fe2+濃度

8、低于50μmol/L時(shí)，其5倍無(wú)菌水稀釋液能完全抑制水霉菌絲生長(zhǎng)：而當(dāng)Fe2+濃度為100μm/L時(shí)，與0、5μmol/L Fe2+濃度組相比，5倍無(wú)菌水稀釋液對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率下降了8.3％，而10倍稀釋組抑制率則分別下降了35.5％、37.7％。同時(shí)研究了M3產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)溫度不敏感；對(duì)pH較不敏感；對(duì)蛋白酶K敏感，蛋白酶作用后對(duì)其拮抗活性有影響。以此可以推斷，M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液中拮抗活性成份為蛋白

9、性質(zhì)的。M3無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液經(jīng)過(guò)截留分子量為3KD的超濾管超濾后濾液的拮抗活性沒有改變，可以推出其拮抗活性物質(zhì)的分子量低于3KD。 為了評(píng)價(jià)M3菌株的應(yīng)用效果，及為將M3作為益生菌開發(fā)的候選菌株提供理論參考依據(jù)，研究了M3對(duì)人工感染異育銀鯽水霉病的防治效果。結(jié)果表明，預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，M3能夠有效預(yù)防水霉病的發(fā)生，降低了異育銀鯽的死亡率，M3實(shí)驗(yàn)組中異育銀鯽水霉病的感染死亡率為53.3％，而對(duì)照組中異育銀鯽的感染死亡率為86.7％；治療實(shí)

10、驗(yàn)中，對(duì)照組中的異育銀鯽在實(shí)驗(yàn)后第3d，死亡率就達(dá)到90％，第4d時(shí)死亡率達(dá)到100％，而M3處理組在實(shí)驗(yàn)的前3d內(nèi)，異育銀鯽的死亡率僅為3.3％，隨著時(shí)間的推遲，死亡率逐漸增大，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡率達(dá)到了90％。 采用ATB細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定M3為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，為了進(jìn)一步確定M3的分類學(xué)地位，測(cè)定了其16S rRNA基因序列，分析了相關(guān)細(xì)菌相應(yīng)序列的同源性，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明M

11、3與Aeromonas hydrophila (DQ095911)親緣關(guān)系最近，因此將M3鑒定為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。研究了其對(duì)異育銀鯽、中華絨鰲蟹的急性毒性，結(jié)果表明，M3菌株對(duì)異育銀鯽、中華絨鰲蟹沒有致病性，是安全的。為了在規(guī)?；a(chǎn)中提高M(jìn)3的培養(yǎng)效率，對(duì)M3的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，測(cè)定了不同溫度、pH、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)M3生長(zhǎng)的影響，并采用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組份配比優(yōu)化，結(jié)果表明，M3生長(zhǎng)