視網(wǎng)膜變性疾病中內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞的變構(gòu)研究.pdf

1、研究背景
　　 視網(wǎng)膜色素變性(retinitispigmentosa,RP)是一類以光感受器細(xì)胞進行性功能障礙為特征，最終導(dǎo)致視覺障礙的一組進行性遺傳性營養(yǎng)不良性退行病變，是世界范圍內(nèi)常見的致盲性眼病。臨床特點主要為進行性視野缺失、夜盲、色素性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜電圖異常。RP好發(fā)于少年和青壯年，患者在青壯年時期出現(xiàn)雙眼視力進行性下降最終視力完全喪失，對患者和社會帶來極重的負(fù)擔(dān)。在中國，每年因視網(wǎng)膜變性疾病失明的患者近100萬，

2、在白內(nèi)障、角膜病、玻璃體疾病等致盲性眼病已有完備的治療方案之后，目前還沒有阻止RP病變進展和恢復(fù)視網(wǎng)膜功能的有效治療方法。盡管在過去的數(shù)十年間，人們對該病的治療進行了各種嘗試，包括視網(wǎng)膜移植、基因治療、視覺假體、藥物干預(yù)等，但至今尚無確切有效、能重建視功能的治療方法。究其根本原因在于視網(wǎng)膜變性的病理機制極為復(fù)雜，在感光細(xì)胞喪失之后內(nèi)層神經(jīng)元也發(fā)生繼發(fā)變性，因此視功能的維持和重建存在巨大的障礙。那么，光感受器細(xì)胞的丟失對視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞

3、究竟產(chǎn)生了什么樣的影響，至今尚不完全清楚，本課題針對視網(wǎng)膜色素變性疾病中的內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變構(gòu)進行探究。
　　 研究中，我們采用皇家外科學(xué)院大鼠(RoyalCollegeofSurgeonsrat，RCS)，這是一種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性的經(jīng)典動物模型，該鼠的感光細(xì)胞進行性變性。既往發(fā)現(xiàn)隨著變性的發(fā)展，視網(wǎng)膜整體電位水平下降，甚至呈熄滅狀態(tài)，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncell，RGC

4、s)的功能也受到嚴(yán)重影響，部分RGCs甚至不能產(chǎn)生動作電位的發(fā)放。那么，在視網(wǎng)膜變性中繼發(fā)感光細(xì)胞喪失之后，內(nèi)層的RGCs的密度分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了什么樣的改變，以及鈣離子的流向在其中起了什么樣的作用，都有待深入探討。
　　 此外另有研究表明在視網(wǎng)膜中存在一種非視覺圖像感光系統(tǒng)，此系統(tǒng)由特殊的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直接進行感光，此類細(xì)胞含有特殊的感光色素melanopsin，稱之為感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Melanopsin-containi

5、ngretinalganglioncells，mRGCs)，在缺乏視桿和視錐細(xì)胞的條件下仍對光線敏感，并且將非圖像視覺信號傳送到下丘腦的視交叉上核(suprachiasmaticnucleus，SCN)，參與生物節(jié)律的形成和瞳孔光反射等。這類細(xì)胞僅占神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞的1％～2％，廣泛分布于整個視網(wǎng)膜，構(gòu)成獨立的感光網(wǎng)絡(luò)。那么，在變性條件下，作為同樣位于視網(wǎng)膜內(nèi)層的神經(jīng)元，mRGCs的分布、細(xì)胞的形態(tài)、突起分支構(gòu)架以及分層，與周圍視網(wǎng)膜神

6、經(jīng)細(xì)胞的聯(lián)系，究竟發(fā)生了什么樣的改變還不清楚。目前，關(guān)于視網(wǎng)膜色素變性過程中各級神經(jīng)元之間突觸結(jié)構(gòu)和功能“重構(gòu)”(remodeling)的機制已成為視網(wǎng)膜色素變性的病理機制研究中的熱點問題。有研究表明視網(wǎng)膜色素細(xì)胞、視桿細(xì)胞由于基因缺陷，或視網(wǎng)膜發(fā)生變性、損傷時，無功能輸入的視網(wǎng)膜神經(jīng)層會啟動一個“重構(gòu)”(remodeling)反應(yīng)。其特點為，上級神經(jīng)元發(fā)出軸索，其末梢形成微神經(jīng)瘤或異常突觸，造成視網(wǎng)膜回路重新連接;神經(jīng)元表面的分子表型

7、喪失或被修改;müller細(xì)胞向外遷徙并形成視網(wǎng)膜下間隙纖維化，使殘存的視網(wǎng)膜無法從色素細(xì)胞和脈絡(luò)膜獲得營養(yǎng)因子和生存支持，光感受器細(xì)胞和神經(jīng)元逐漸死亡。那么mRGCs是否參與了重構(gòu)，它的這種改變，對于視網(wǎng)膜變性中視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保留、視覺功能的重建有什么樣的提示。
　　 為此，本研究擬采用視網(wǎng)膜變性RCS大鼠，通過熒光金(Fluorogold)逆行標(biāo)記RGCs、抗melanopsin抗體免疫熒光標(biāo)記mRGCs，激光共聚焦顯微鏡

8、觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鈣離子成像及感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的變化，初步探討視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)感光細(xì)胞變性死亡的可能機制。
　　 本課題在以下兩個方面進行較為深入的研究后得到如下結(jié)果和結(jié)論:
　　 第一部分視網(wǎng)膜色素變性疾病中RGCs形態(tài)改變及鈣流的變化
　　 目的
　　 研究RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells，RGCs)分布、密度、細(xì)胞形態(tài)，以及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化

9、，探討視網(wǎng)膜變性對RGCs的影響以及可能的觸發(fā)因素。
　　 方法
　　 采用視網(wǎng)膜變性RCS大鼠和正常對照大鼠，分為變性組和對照組。按生后21天(P21d)、60天(P60d)以及90天(P90d)分3個時間段，每時間點各6只大鼠，采用立體定位下行RCS大鼠上丘和外膝體Fluorogold逆行標(biāo)記RGCs，熒光顯微鏡下行視網(wǎng)膜鋪片觀察，研究RGCs在視網(wǎng)膜變性中的分布、形態(tài)和突起變化，以及密度改變。以及采用fluo-4A

10、M孵育活體狀態(tài)下的視網(wǎng)膜鋪片和切片，行激光共聚焦觀察RGCs胞內(nèi)鈣成像，分析RGCs在變性過程中胞內(nèi)鈣濃度的變化。
　　 結(jié)果
　　 熒光標(biāo)記的RGCs分布于整個視網(wǎng)膜，沿神經(jīng)纖維走形分布，細(xì)胞胞體和突起清晰可見。RCS大鼠變性晚期RGCs胞體大小不一，細(xì)胞分布較稀疏，細(xì)胞突起分枝數(shù)和范圍減小，RCS大鼠RGCs密度P21d時為5400±109/mm2，P60d時4167±134/mm2，P90d時2807±161/mm

11、2，隨著變性發(fā)展神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(F=536.463，P=0.000)，與同組的Control大鼠統(tǒng)計學(xué)比較差異非常顯著(t60=24.172，t90=30.131，P=0.000)，P60d時RCS大鼠存活的RGCs占同期Control大鼠的約80％，P90d時約占58％。變性晚期RCS大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)鈣呈高強表達，表現(xiàn)為鈣超載現(xiàn)象，P60d、P90d時變性RCS大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)鈣強度分別為335.0±20.8U/m

12、m2和420.2±43.0U/mm2與對照大鼠相比差異非常顯著(t60=-18.058，t90=-15.015，P=0.000)，同時鈣熒光不僅表達在RGCs的胞體，也表達在樹突上，向內(nèi)叢狀層延伸。
　　 結(jié)論
　　 變性晚期RCS大鼠RGCs繼發(fā)感光細(xì)胞的喪失也發(fā)生變性死亡，細(xì)胞形態(tài)和分布密度受到顯著影響，RGCs胞內(nèi)鈣濃度的變化可能是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性、死亡的觸發(fā)因素:RCS大鼠變性晚期RGCs由于胞內(nèi)鈣的增加，激活一系

13、列級聯(lián)反應(yīng)，最終引起胞膜上受體和通道的改變，最終使得RGCs功能失活甚至變性死亡。因此我們推測，視網(wǎng)膜變性中RGCs胞內(nèi)鈣濃度的變化是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性、死亡的可能觸發(fā)因素。
　　 第二部分視網(wǎng)膜色素變性疾病中mRGCs及周圍神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的變構(gòu)
　　 目的
　　 含melanopsin的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可直接感光，并調(diào)制生物節(jié)律和瞳孔光反射等，探討此種特殊的感光細(xì)胞即感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mRGCs，在視網(wǎng)膜變性疾病中的結(jié)構(gòu)改變

14、和周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的變構(gòu)。
　　 方法
　　 采用經(jīng)典的視網(wǎng)膜變性動物模型RCS大鼠，及正常大鼠，分為變性組和對照組。按生后21天(P21d)、60天(P60d)以及90天(P90d)分3個時間段，每時間點各6只大鼠，實驗中行抗melanopsin免疫熒光染色，視網(wǎng)膜鋪片，激光共聚焦顯微鏡觀察，計算機分析mRGCs的胞體形態(tài)、視網(wǎng)膜內(nèi)的分布、突起分支形態(tài)和分層。
　　 結(jié)果
　　 隨著感光細(xì)胞的丟失，R

15、GCs也顯著減少，而mRGCs卻得以保留。視網(wǎng)膜變性RCS大鼠mRGCs的胞體形態(tài)、分布范圍和數(shù)量和正常對照大鼠相似。視網(wǎng)膜變性RCS大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的感光神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度，P21d時148±10/mm2，P60d時135±8/mm2，P90d時136±17/mm2，不同階段差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.892，P=0.185)。而變性后期（P60d和P90d）mRGCs突起上melanopsin的表達明顯增強，樹突的網(wǎng)絡(luò)變密集，樹突分支明顯