腫瘤抗原MAGE-A9、-A10、-A12在乳腺癌組織中的表達(dá)及對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目前,以免疫治療為代表的生物治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種腫瘤治療模式,成為近年來國際上研究的熱點(diǎn),其中,針對腫瘤抗原的靶向治療以展示出良好的優(yōu)勢。在已知的眾多腫瘤相關(guān)抗原中,癌睪丸抗原(cancer/testis antigen,CTA)有特異的表達(dá)模式,即在各種腫瘤組織中有不同頻率的表達(dá),而在正常組織中僅在睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá),偶在胎盤中表達(dá)。但睪丸是免疫豁免器官,不引起機(jī)體特異性免疫反應(yīng)。因此,CTA適于作為特異性腫瘤免

2、疫治療的靶抗原。
　　 作為CTA亞家族的黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene,MAGE)是從黑色素瘤細(xì)胞中分離出來的一大家族抗原基因。MAGE基因編碼的腫瘤排斥抗原在細(xì)胞內(nèi)被加工產(chǎn)生抗原肽,與HLA-Ⅰ類分子結(jié)合形成復(fù)合物,能夠被自體細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別,誘導(dǎo)出對相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。因此,對MAGE的深入研究將會(huì)為腫瘤分子學(xué)診斷和腫瘤免疫治療提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本研究采用免疫組織化學(xué)

3、染色法檢測了MAGE家族成員MAGE-A9、-A10、-A12在乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁正常乳腺組織中的表達(dá),分析了其表達(dá)與乳腺癌臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性。采用MTT法分析及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測了MAGE-A9X寸乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 第一部分：腫瘤抗原MAGE-A9、-A10、-A12在乳腺癌組織中的表達(dá)及與乳腺癌臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系
　　 目的:通過檢測MAGE-A9、-A10、-A12

4、在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá),探討其表達(dá)與乳腺癌臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測60例乳腺癌組織及16例相應(yīng)癌旁正常乳腺組織中MAGE-A9、-A10、-A12的蛋白表達(dá)狀況,并分析其表達(dá)與乳腺癌臨床生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1：在陽性對照的正常睪丸組織中,MAGE-A9主要在初級精母細(xì)胞和精原細(xì)胞中表達(dá),且胞漿胞核都有表達(dá)。在乳腺癌組織中,

5、MAGE-A9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),部分表達(dá)于細(xì)胞核。16例正常乳腺組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A9的表達(dá),60例乳腺癌組織有28例MAGE-A9蛋白表達(dá)陽性,陽性率為46.7％,提示MAGE-A9為腫瘤特異性抗原。
　　 在乳腺癌組織中,MAGE-A9蛋白表達(dá)陽性率隨著C-erbB2和ER-β表達(dá)率的增加而增加(Z=-2.757,P=0.006)、(Z=-2.187,P=0.029)。MAGE-A9蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的年齡(X2=0.

6、804,P=0.370)、病理類型(X2=0.000,P=1.000)、組織學(xué)分級(Z=-0.935,P=0.350)、臨床分期(X2=0.000,P=1.000)、腫瘤大小(X2=0.741,P=0.690)、淋巴轉(zhuǎn)移(X2=0.268,P=0.605)、ER-α(Z=-0.746,P=0.455)、PR(Z=-0.031,P=0.975)及AIB-Ⅰ(Z=-1.159,P=0.247)表達(dá)均無相關(guān)性。
　　 2：在陽性對照的

7、正常睪丸組織中,MAGE-A10主要在初級精母細(xì)胞和精原細(xì)胞中表達(dá),且胞漿胞核都表達(dá)。在乳腺癌組織中,MAGE-A10主要定位于細(xì)胞質(zhì),部分定位于細(xì)胞核。16例正常乳腺組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A10的表達(dá),60例乳腺癌組織有44例MAGE-A10蛋白表達(dá)陽性,陽性率為73.33％,提示MAGE-A10為腫瘤特異性抗原。
　　 MAGE-A10蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的年齡(X2=0.114,P=0.736)、病理類型(x2=0.809

8、,P=0.368)、組織學(xué)分級(Z=-0.772,P=0.440)、臨床分期(X2=1.378,P=0.241)、腫瘤大小(X2=0.861,P=0.650)、淋巴轉(zhuǎn)移(X2=0.000,P=1.000)、ER-α(Z=-1.362,P=0.173)、C-erbB2(Z=-0.919,P=0.358)、ER-β(Z=-0.495,P=0.620)、PR(Z=-1.136,P=0.256)及AIB-Ⅰ(Z=-0.563,P=0.574)表

9、達(dá)均無相關(guān)性。
　　 3：在陽性對照的正常睪丸組織中,MAGE-A12主要在初級精母細(xì)胞和精原細(xì)胞中表達(dá),且胞漿胞核都有表達(dá)。在乳腺癌組織中,MAGE-A12主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),部分表達(dá)于細(xì)胞核。16例乳腺正常組織中未發(fā)現(xiàn)MAGE-A12的表達(dá),60例乳腺癌組織有56例MAGE-A12蛋白表達(dá)陽性,陽性率為93.33％,提示MAGE-A12為腫瘤特異性抗原。
　　 MAGE-A12蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的年齡(X2=0.35

10、7,P=0.550)、病理類型(X2=1.702,P=0.192)、組織學(xué)分級(z=-0.058,P=0.954)、臨床分期(X2=0.000,P=1.000)、腫瘤大小(X2=0.117,P=0.943)、淋巴轉(zhuǎn)移(X2=0.000,P=1.000)、ER-α(Z=-1.366,P=0.172)、C-erbB2(Z=-1.316,P=0.188)、ER-β(Z=-1.496,P=0.135)、PR(Z=-1.779,P=0.075)及

11、AIB-Ⅰ(Z=-0.322,P=0.748)表達(dá)均無相關(guān)性。
　　 460例乳腺癌組織標(biāo)本中,MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12蛋白表達(dá)呈不均勻分布。78.33％的標(biāo)本至少表達(dá)一種上述的MAGE蛋白(47/60)。在60例乳腺癌標(biāo)本中MAGE-A9、MAGE-A10蛋白同時(shí)表達(dá)的有25例,占41.67％(25/60),MAGE-A10、MAGE-A12蛋白同時(shí)表達(dá)的有21例,占35％(21/60),MAGE-A

12、9、MAGE-A12蛋白同時(shí)表達(dá)的有15例,占25％(15/60)。三種蛋白同時(shí)表達(dá)的有4例,占23.33％(14/60)。60例乳腺癌組織中3種蛋白陽性表達(dá)率之間無明顯差異(X2=0.000,P=1.000＞0.05)。如上所述MAGE-A家族的表達(dá)具有聚集性。
　　 結(jié)論:
　　 1：MAGE-A9是一種腫瘤特異性抗原。
　　 2：在乳腺癌組織中,MAGE-A9蛋白的表達(dá)率隨著C-erbB2和NER-β表達(dá)率

13、的增加而增加。推測,MAGE-A9有可能成為指導(dǎo)乳腺癌治療及判斷預(yù)后的一個(gè)重要參考指標(biāo)。
　　 3：MAGE-A家族分子在乳腺癌中表達(dá)有聚集現(xiàn)象。
　　 第二部分：MAGE-A9對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響；
　　 目的:研究MAGE-A9對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:
　　 通過細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR、Western-blot方法檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中MAG

14、E-A9和C-erbB2的表達(dá)情況;通過MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)研究MAGE-A9對細(xì)胞增殖的影響;用免疫共沉淀法檢測MAGE-A9和C-erbB2蛋白的相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1：MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,MAGE-A9和C-erbB2在基因轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)均為陽性,并且C-erbB2在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平弱于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2：MCF-7和MDA-MB-23

15、1細(xì)胞中,MAGE-A9在蛋白水平表達(dá)均為陰性;C-erbB2表達(dá)均為陽性,且C-erbB2在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平弱于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 3：將MAGE-A9基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,體外培養(yǎng)48h后,細(xì)胞的增殖率與轉(zhuǎn)染空載體對照組相比顯著增加(P＜0.05)。
　　 4：克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MAGE-A9基因,并經(jīng)G418篩選兩周后,MCF-7細(xì)胞克隆形成數(shù)為463±53.5,明顯高于