戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(HEV)為單鏈RNA病毒，無(wú)包膜，主要通過(guò)胃腸道傳播，引起急性戊型肝炎。戊型肝炎呈全球性分布，但主要累及發(fā)展中國(guó)家，是一種普遍流行、危害嚴(yán)重的疾病。HEV的廣泛存在，已經(jīng)成為一項(xiàng)關(guān)系公眾健康和社會(huì)穩(wěn)定的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)與研制戊型肝炎疫苗對(duì)阻止HEV的傳播及提高人口質(zhì)量和衛(wèi)生保健水平有著深遠(yuǎn)的意義。 由于HEV細(xì)胞培養(yǎng)尚不成功，目前主要研究HEV重組疫苗，ORF2及其編碼蛋白是目前研究最多的戊型肝炎候選疫

2、苗成分。由于HEV是一種經(jīng)胃腸道途徑傳播的病毒，因此通過(guò)口服等免疫誘導(dǎo)胃腸道局部粘膜免疫對(duì)抵抗HEV感染會(huì)有重要作用。本研究以減毒鼠傷寒沙門氏菌作為載體，采用來(lái)自南京地區(qū)戊型肝炎散發(fā)病例的第Ⅳ基因型毒株，選用其編碼ORF2蛋白中含HEV中和抗原表位的439-617位氨基酸(p179)片段的基因序列，將其與PYA3341質(zhì)粒重組并轉(zhuǎn)化減毒鼠沙門氏菌χ4550，建立了能穩(wěn)定表達(dá)p179蛋白的戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗株。我們將此疫苗

3、株通過(guò)口服和鼻飼兩種不同途徑免疫小鼠，觀察其免疫效果。本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分： 1南京地區(qū)戊型肝炎病毒基因型的鑒定及毒株的選擇 利用逆轉(zhuǎn)錄巢式聚合酶鏈反應(yīng)(RT-nPCR)的方法檢測(cè)南京地區(qū)40份急性散發(fā)性戊型肝炎患者的糞便標(biāo)本，將所獲得的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。采用分子生物學(xué)軟件LASERGENE和PHYLIP軟件包進(jìn)行序列的同源性比較、遺傳距離計(jì)算以及基因進(jìn)化樹(shù)的繪制，利用生物信息學(xué)軟件比較核苷酸的同源性、遺傳距離，進(jìn)行

4、基因分型。40份糞便標(biāo)本中檢測(cè)到14份陽(yáng)性HEVRNA，檢出率為35％，基因分型均為Ⅳ型HEV，說(shuō)明南京地區(qū)散發(fā)性戊型肝炎均由Ⅳ型HEV引起，提示目前國(guó)內(nèi)散發(fā)性戊型肝炎的病原主要為Ⅳ型HEV。因此我們選擇Ⅳ型HEV毒株ORF2蛋白中439-617位氨基酸(p179)片段進(jìn)行構(gòu)建戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗。 2戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗株的構(gòu)建與鑒定 應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)HEVORF2蛋白-p179

5、的減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗。用RT-PCR方法擴(kuò)增HEVORF2編碼HEV中和抗原表位的基因片段，將其插入表達(dá)載體PYA3341中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PYA3341-179，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門氏菌疫苗株χ550，獲得重組菌株χ4550(PYA3341-179)。應(yīng)用免疫印跡對(duì)重組菌所表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行免疫分析，其結(jié)果顯示該重組菌可表達(dá)重組ORF2蛋白，并且可以與病人血清和不同基因型HEV單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；該無(wú)抗藥性的雜合菌株

6、在體外營(yíng)養(yǎng)選擇壓力下可較穩(wěn)定攜帶重組質(zhì)粒傳代繁殖。用免疫劑量的重細(xì)細(xì)菌免疫BALB/c小鼠后，觀察一個(gè)月未見(jiàn)有異常現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌株在體內(nèi)也可較穩(wěn)定攜帶重組質(zhì)粒傳代繁殖。表明戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌重組菌株χ4550(PYA3341-179)可用于戊型肝炎疫苗的研究。 3戊型肝炎重組候選疫苗株χ4550(PYA3341-179)的體液免疫學(xué)特性 將減毒鼠傷寒沙門氏菌χ4550和所構(gòu)建的重組菌株χ4550(PYA334

7、1-179)以4×1011菌落形成單位(CFU)/只劑量，用口服和鼻飼兩種不同途徑免疫雌性BALB/c小鼠，分成4組，每組6只。分別采集免疫前以及免疫后的小鼠血清、糞便標(biāo)本。用來(lái)自7種基因型和亞型HEVORF2C端p166多肽的重組蛋白混合物(p166Mix)和內(nèi)毒素(LPS)作為抗原，檢測(cè)各組血清、糞便標(biāo)本中特異性的IgG和IgA。結(jié)果表明，在血清標(biāo)本中，存在抗p179蛋白和LPS特異性的IgG；而在小鼠糞便標(biāo)本中測(cè)出抗上述兩種抗原的

8、特異性IgA。結(jié)果表明我們所構(gòu)建的戊型肝炎減毒傷寒沙門氏菌重組菌株χ4550(PYA3341-179)免疫小鼠后，能夠誘導(dǎo)HEV特異性的IgG和IgA。 綜上所述，我們通過(guò)對(duì)南京地區(qū)HEV的基因型的鑒定，選取了HEVⅣ型毒株ORF2蛋白中439-617位氨基酸(p179)片段進(jìn)行構(gòu)建戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗株;所構(gòu)建的重細(xì)疫苗株χ4550(PYA3341-179)在體外能夠與不同病人血清和不同基因型HEV單克隆抗體發(fā)生