不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究.pdf

1、游離小孢子培養(yǎng)（Isolated Microspore Culture，IMC）技術(shù)可以加快育種進程，特別是對于不結(jié)球白菜和青花菜等異花授粉作物。在短時間內(nèi)可獲得大量單倍體或純合二倍體，在作物遺傳育種、遺傳分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記等方面具有重要的作用。本實驗對不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進行了研究，探明影響其胚胎發(fā)生及植株再生的主要因素，優(yōu)化不結(jié)球白菜乖青花菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，這將對于加快不結(jié)球白菜和青花菜等蕓薹屬蔬

2、菜作物育種效率及促進其遺傳分析等方面具有重要的意義。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　以20個基因型的不結(jié)球白菜和10個基因型的青花菜為材料，確定了小孢子發(fā)育時期與花蕾長度的關(guān)系，研究了基因型對不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響。研究發(fā)現(xiàn)同一花蕾中小孢子核的發(fā)育存在著不同步性，但小孢子發(fā)育時期與花蕾長度存在著一定的對應(yīng)關(guān)系。一般而言，不結(jié)球白菜一般選擇2～3mm長的花蕾，青花菜一般選擇3～4mm長的花蕾進行游離小孢子

3、培養(yǎng);在20個不結(jié)球白菜供體基因型中有13個材料誘導(dǎo)出胚，占總不結(jié)球白菜供試材料的65％，其中最高出胚率達12.17胚/蕾;10個青花菜供體基因型中有4個材料誘導(dǎo)出胚，占總青花菜供試材料的40％，其中最高出胚率為4.30胚/蕾;因此，不同基因型的不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率存在差異。
　　以基因型‘LBC-80’、‘LBC-82’和‘LBC-83’為材料，研究了小孢子培養(yǎng)密度、活性炭濃度和溫度脅迫處理對游離小孢子培

4、養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響。當(dāng)小孢子培養(yǎng)密度為每毫升1～2個蕾時，胚胎發(fā)生率較高;添加0.50 mg/mL的活性碳最有利于小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生;熱激處理是誘導(dǎo)游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的必要條件，花蕾低溫預(yù)處理并非胚胎發(fā)生的必要條件;花蕾低溫預(yù)處理和小孢子熱激處理共同使用效果更好，胚胎發(fā)生率顯著提高。
　　以出胚率較高的基因型‘LBC-82’和‘A47-4’為材料，利用DAPI熒光染色液對培養(yǎng)中的小孢子每隔一天進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察了其

5、胚胎發(fā)育過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，按照小孢子胚胎發(fā)育第一次分裂方式劃分，不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)育過程中A、B途徑都同時存在。熱激培養(yǎng)1d后，多數(shù)存活的小孢子體積增大，有些小孢子細(xì)胞開始發(fā)生對稱性或者不對稱性分裂，第4d發(fā)生分裂的細(xì)胞數(shù)增多;隨著小孢子的進一步分裂發(fā)育，會相繼出現(xiàn)四細(xì)胞原胚、多細(xì)胞團、球型胚、心型胚、魚雷型胚和子葉型胚的結(jié)構(gòu);約從18天開始，在培養(yǎng)皿中就會出現(xiàn)大量的肉眼可見的胚狀體。
　　以基因型‘LBC-54

6、9’、‘A36-5’、‘A47-4’和‘A48-3’的胚狀體為供試材料，探究了胚齡、瓊脂濃度和添加椰汁對小孢子胚胎植株再生的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在NLN液體培養(yǎng)基中胚齡為20～29天的胚狀體轉(zhuǎn)入到B5固體培養(yǎng)基中發(fā)育較快，再生率較高;含1％瓊脂的B5固體培養(yǎng)基比含0.78％瓊脂的B5固體培養(yǎng)基更有利于小孢子胚的進一步誘導(dǎo)，且有利于植株再生;培養(yǎng)基中加入10％的椰汁，能夠促進不結(jié)球白菜和青花菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株的生長，使其健壯、整齊，莖粗