L428-MVC-EVC細(xì)胞及其NF-κB表型和功能初步研究.pdf

1、因特網(wǎng)上生物信息資源的快速查找與充分利用，為生物醫(yī)學(xué)研究者提供了有價(jià)值的信息和研究手段。GeneSifter軟件是一個(gè)以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)集統(tǒng)計(jì)分析和生物學(xué)功能分析為一體的基因芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤易感基因及其相關(guān)的信號(hào)通路，具有重要的價(jià)值，已有不少學(xué)者通過(guò)GeneSifter軟件尋找感興趣的致癌基因或抑癌基因，為進(jìn)一步的科學(xué)研究和相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了科學(xué)的依據(jù)。 近年關(guān)于霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）腫瘤細(xì)胞-

2、H/RS細(xì)胞的形成過(guò)程及其相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究有了很大的進(jìn)展，初步研究表明H/RS細(xì)胞起源于“殘疾B淋巴細(xì)胞”，其中潛伏膜蛋白-1（LMP-1）的表達(dá)、CD99基因缺失和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的持續(xù)活化是H/RS細(xì)胞形成的三大要素，特別是mic2/CD99基因缺失與H/RS細(xì)胞的發(fā)生有直接關(guān)系。 用SiRNA技術(shù)將人B淋巴瘤細(xì)胞株BJAB和IM9的CD99基因沉默，結(jié)果可出現(xiàn)像HL一

3、樣的H/RS細(xì)胞的典型特征，出現(xiàn)H/RS樣“鏡影細(xì)胞”，高表達(dá)CD30和CD15；當(dāng)再將CD99基因轉(zhuǎn)入上述H/RS樣細(xì)胞中，又可使出現(xiàn)的H/RS樣細(xì)胞的形態(tài)特征消失，該細(xì)胞又恢復(fù)到B細(xì)胞淋巴瘤原有的表型特征，提示H/RS細(xì)胞的發(fā)生及免疫表型的變化與CD99基因表達(dá)缺失有關(guān)。 由于經(jīng)典型HL（classical Hodgkin lymphoma，cHL）來(lái)源于前凋亡生發(fā)中心B（germinal center B-cell，GCB

4、）細(xì)胞，調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化和存活的重要轉(zhuǎn)錄因子核因子κB基因（NF-κB）也成為研究H/RS細(xì)胞的重要因素。NF-κB屬于一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，NF-κB調(diào)節(jié)很多的基因表達(dá)，這些基因與細(xì)胞增殖、分化、免疫反應(yīng)、凋亡、轉(zhuǎn)化有著密切關(guān)系。在培養(yǎng)的HL細(xì)胞株和原代H/RS細(xì)胞核中檢測(cè)到NF-κB與DNA結(jié)合的活性持續(xù)升高。在HL病人的活檢標(biāo)本免疫組化染色也證實(shí)存在大量活化的NF-κB/RelA。NF-κB的持續(xù)活化是

5、H/RS細(xì)胞生存的必要條件。 本課題組前期研究將高表達(dá)mCD99L2基因的小鼠B淋巴瘤細(xì)胞株A20細(xì)胞的mCD99L2基因沉默，下調(diào)CD99基因的表達(dá)，可誘導(dǎo)出H/RS樣細(xì)胞的產(chǎn)生，并從免疫表型、生物學(xué)特性等方面驗(yàn)證其具有H/RS細(xì)胞部分特性。 如果本研究將低表達(dá)CD99基因的人HL細(xì)胞株L428細(xì)胞上調(diào)CD99基因表達(dá)，能否在基因修飾后使其H/RS細(xì)胞特性消失或改變？與NF-κB的關(guān)系又如何呢？L428細(xì)胞株主要由大細(xì)

6、胞（直徑≥25um）、小細(xì)胞（直徑≤10um）和介于兩者之間的細(xì)胞混雜組成，一種細(xì)胞系中為什么會(huì)出現(xiàn)大小不同的細(xì)胞混合共生？是否與NF-κB活化有關(guān)？如果抑制NF-κB活化，又會(huì)怎樣的改變呢？ 鑒于此，本研究首先利用生物信息學(xué)探究CD99基因與NF-κB的關(guān)系，然后追蹤觀測(cè)比較L428大小細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及轉(zhuǎn)化規(guī)律，上調(diào)低表達(dá)CD99基因的L428細(xì)胞株CD99基因，在該細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)CD99基因克隆株的基礎(chǔ)上，連續(xù)觀測(cè)該株細(xì)胞

7、中H/RS細(xì)胞的形態(tài)及表型改變，并探究bortezomib抑制NF-κB后CD99基因與NF-κB在HL中調(diào)節(jié)關(guān)系，為進(jìn)一步研究HL中H/RS細(xì)胞形成的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的： 1.借助生物信息學(xué)軟件對(duì)CD99基因與HL相關(guān)性的基因進(jìn)行檢索和分析。利用當(dāng)前常用的基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD99基因和HL瘤組織中各種基因的表達(dá)及差異，探尋CD99基因與HL之間的相互關(guān)系。 2.以探究CD99基因?qū)LH/RS細(xì)胞的影響

8、，對(duì)比轉(zhuǎn)染CD99基因前后、bortezomib干預(yù)前后CD99基因與NF-κB的相關(guān)關(guān)系，探討CD99基因是否通過(guò)NF-κB起作用，并為本研究后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)。 3.將L428-MVC、L428-EVC細(xì)胞亞系進(jìn)行細(xì)胞周期、凋亡、生長(zhǎng)曲線分析，及體內(nèi)成瘤情況觀察，探究CD99基因在HL中所起的作用。 方法： 1.從GEO DataSets下載CD99基因與HL細(xì)胞株及組織中的基因芯片數(shù)據(jù)，提交至基因芯片在線分析

9、工具GeneSifter后，對(duì)CD99基因與HL所表達(dá)的NF-κB進(jìn)行基因表達(dá)差異分析、KEGG通路分析。 2.用計(jì)數(shù)板確定細(xì)胞數(shù)量，并根據(jù)細(xì)胞數(shù)量用含胎牛血清的1640將培養(yǎng)的L428細(xì)胞株持續(xù)稀釋成單個(gè)大細(xì)胞（直徑≥25um）、單個(gè)小細(xì)胞（直徑≤10um）于96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，并在光鏡、掃描電鏡下進(jìn)行連續(xù)觀察其生長(zhǎng)周期，并檢測(cè)NF-κB的活化情況。 3.利用本課題前期將CD99/mic2基因成功轉(zhuǎn)染至L428細(xì)胞中的細(xì)

10、胞株命名為L(zhǎng)428-MVC（L428-mic2 vector construct，L428-MVC）的基礎(chǔ)上，通過(guò)免疫組化對(duì)L428與L428-MVC克隆株細(xì)胞的形態(tài)及表型進(jìn)行對(duì)比分析，免疫組化檢測(cè)CD99、CD30、CD15、CD2、CD3、CD20、CD79在L428-MVC和L428細(xì)胞中的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L428-MVC、L428細(xì)胞CD30和CD15的表達(dá)，光鏡、掃描電鏡、透射電鏡下觀察L428與L428-MVC細(xì)胞形態(tài)特

11、征，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的L428細(xì)胞株命名為L(zhǎng)428-EVC（L428-empty vector construct，L428-EVC）為對(duì)照。應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)、MTT法以及體內(nèi)成瘤試驗(yàn)，觀察CD99基因?qū)428細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡、增殖的影響；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法、Westernblot分析L428轉(zhuǎn)染CD99基因前后NF-κB的變化，觀察bortezomib對(duì)L428細(xì)胞、NF-κB抑制的影響、與CD99基因的調(diào)節(jié)關(guān)系，以及接種B

12、ALB/c小鼠和BALB/c-nu/nu裸鼠體內(nèi)成瘤試驗(yàn)的影響。 結(jié)果： 1.差異基因分析中發(fā)現(xiàn)，與CD99基因相比，從GeneSifter中挖掘出與HL有關(guān)的顯著高豐度基因1568種，除發(fā)現(xiàn)NF-κB基因外，還發(fā)現(xiàn)了脂肪酸合成相關(guān)基因。從差異基因KEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)NF-κB參與MAPK及TOLL樣受體等信號(hào)通路中。 2.經(jīng)持續(xù)稀釋成單個(gè)大細(xì)胞、單個(gè)小細(xì)胞的L428細(xì)胞，小細(xì)胞可分裂轉(zhuǎn)化成大細(xì)胞，大細(xì)胞亦可生

13、成小細(xì)胞；常見(jiàn)單個(gè)大細(xì)胞周圍出現(xiàn)多個(gè)小細(xì)胞圍繞的現(xiàn)象，在此過(guò)程中NF-κB一直持續(xù)活化。 3.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，L428組中的大細(xì)胞或H/RS樣細(xì)胞（直徑≥25μm）比例為（11.6±1.5）%，L428-MVC組細(xì)胞中H/RS樣細(xì)胞的比例為（4.6±0.7）%，L428-EVC組為（13.1±1.3）%。L428、L428-EVC細(xì)胞CD30和CD15表達(dá)陽(yáng)性，CD99表達(dá)則為陰性；而L428-MVC表達(dá)CD99則為陽(yáng)性，同時(shí)

14、發(fā)現(xiàn)L428-MVC所表達(dá)CD2、CD3、CD20、CD79仍為陰性。透射電鏡發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CD99基因后的L428細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)體增多，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)L428-MVC細(xì)胞表面突起減少。L428-MVC細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖高于L428細(xì)胞株和L428-EVC細(xì)胞株（P<0.01），其細(xì)胞凋亡亦顯著增加，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。與L428-MVC細(xì)胞相比，免疫組化及Westernblot均顯示L428、L428-EVC表達(dá)的NF-κB顯著升高。120

15、nmol/L的bortezomib對(duì)L428細(xì)胞株抑制后發(fā)現(xiàn)NF-κB阻斷明顯，但并未引起CD99重新表達(dá)。L428、L428-EVC及L428-MVC細(xì)胞株均未在BALB/c小鼠和BALB/c-nu/nu裸鼠體內(nèi)成瘤。 結(jié)論： 1.NF-κB基因持續(xù)活化與H/RS細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。H/RS細(xì)胞則顯示明顯的NF-κB活性，在HL細(xì)胞中滅活NF-κB將引起細(xì)胞凋亡。 2.CD99基因可導(dǎo)致L428大細(xì)胞形態(tài)

16、變小，其特征性的細(xì)胞表面標(biāo)記CD15、CD30消失，CD99基因?qū)428細(xì)胞增殖起正調(diào)節(jié)作用，但同時(shí)引起細(xì)胞凋亡亦增加，CD99基因?qū)F-κB起調(diào)控作用，而NF-κB對(duì)CD99基因無(wú)反調(diào)節(jié)作用，同時(shí)CD99基因不增加致瘤性。 3.L428大小兩種腫瘤細(xì)胞，小細(xì)胞經(jīng)歷從小至大，大細(xì)胞可分裂成眾多小細(xì)胞的過(guò)程，在單個(gè)大細(xì)胞周圍常出現(xiàn)多個(gè)小細(xì)胞圍集的現(xiàn)象。 4.上調(diào)HL細(xì)胞的CD99基因可導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)體含量增多，可能與脂